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1.
哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中,哺乳动物细胞生长活力差,且容易发生细胞凋亡,因而难以大规模培养。为解决此问题,应用双顺反子表达载体在CHO-dhfr-细胞中同时表达Igf-1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合,通过Bcl-2使细胞获得抗凋亡能力;通过Igf-1或Cyclin E促进细胞生长分裂,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO-dhfr-细胞,应用Western blot从G418抗性克隆中分别筛选到Bcl-2高表达克隆若干个,对其中表达Bcl-2最高的CHO-IB3和CHO-BC1做进一步Western blot和流式细胞分析,确认此两个细胞株分别高表达Igf-1/Bcl-2和Bcl-2/Cyclin E基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡,并以流式细胞术和DNA Ladder法检测细胞凋亡,证明CHO-IB3和CHO-BC1均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO-dhfr-对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明,CHO-IB3和CHO-BC1在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHOdhfr-对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长,适于作为生物工程宿主细胞。  相似文献   

2.
PI3K/Akt信号通路是由酶联受体介导的信号转导通路,该通路不仅参与多种生长因子、细胞因子和细胞外基质等的信号转导,同时还参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节,特别是在细胞凋亡、细胞存活以及调控细胞糖代谢等方面具有重要作用。本研究综述了PI3K-Akt信号通路的结构组成、通路活化、通信过程、调控机制及其生物学功能等方面的研究进展,为进一步研究PI3K/Akt信号通路的生物学调控作用机制提供启示。  相似文献   

3.
p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53, ASPP2)能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡的功能,进而发挥抗肿瘤作用. 本室前期研究发现,ASPP2可以通过p53-DRAM自噬途径诱导细胞凋亡. 在本研究中,利用ASPP2 腺病毒感染Hep3B细胞(p53缺陷型肝癌细胞系)并用甲基磺酸(MMS)处理后; Calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡;GFP-LC3质粒转染细胞后检测自噬; 荧光定量PCR和免疫印迹检测自噬基因表达. 结果表明,ASPP2在p53缺陷的Hep3B细胞内可诱导发生凋亡;在MMS存在和缺失条件下, Adr-ASPP2均引起自噬体水平升高及自噬基因的表达增 加,且MMS协同Adr-ASPP2能使自噬水平增加; 进一步用VPS34 siRNA和DRAM siRNA抑 制自噬发现,细胞凋亡水平下降, 说明由Adr-ASPP2诱发经损伤相关自噬调节蛋白( DRAM)介导的自噬参与了肝癌细胞系凋亡的发生. 综上结果表明,ASPP2可以通过非p53依赖的DRAM介导自噬,并促进肝癌细胞凋亡. 该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.  相似文献   

4.
哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中,哺乳动物细胞生长活力差,且容易发生细胞凋亡,因而难以大规模培养。为解决此问题,应用双顺反子表达载体在CHO-dhfr^-细胞中同时表达Igf-1/Bcl-2或Bcl-2/CyclinE基因组合,通过Bcl-2使细胞获得抗凋亡能力;通过1gf-1或CyclinE促进细胞生长分裂,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO-dhfr^-细胞,应用Western blot从G418抗性克隆中分别筛选到Bcl-2高表达克隆若干个,对其中表达Bcl-2最高的CHO-IB3和CHO-Bcl做进一步Western blot和流式细胞分析,确认此两个细胞株分别高表达Igf-1/Bcl-2和Bcl-2/CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡,并以流式细胞术和DNA Ladder法检测细胞凋亡,证明CHO-IB3和CHO一BCl均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO-dhfr^-对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明,CHO-IB3和CHO-BCl在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO-dhfr^-对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长,适于作为生物工程宿主细胞。  相似文献   

5.
力生长因子(mechano growth factor,MGF)是新近发现的一种生长因子,由Igf-1基因剪接变异产生,拉伸刺激会促使成骨细胞表达力生长因子.比较分析了MGF及其羧基端E肽(MGF-Ct24E)对成骨细胞前体细胞MC3T3-E1分化的影响.结果显示:MGF和MGF-Ct24E具有显著激活胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)的作用,并降低了成骨细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达,促进了骨桥蛋白(OPN)的表达,减少了核心绑定因子(corebinding factor1,Cbfα-1)的核转运量,对成骨细胞的分化具有延迟效应,这种效应通过抑制剂PD98059抑制Erk1/2的活化得到逆转;MGF还能显著激活磷脂酰肌醇3-激酶信号通路中的蛋白激酶B(Akt),该活化作用对成骨细胞分化是必需的,钙沉积分析显示长期培养下的细胞MGF促进了矿化节结的形成.这些结果说明,MGF-Ct24E对成骨细胞的分化具有抑制作用,这种作用与Erk1/2的活化有关,MGF因为包含E肽和IGF-1部分,能分别激活Erk1/2和Akt,因此对成骨细胞分化表现出双重效用,在成骨细胞分化早期,具有一定的延迟效应,而在分化晚期对成骨...  相似文献   

6.
目的研究转染细胞周期依赖性蛋白激酶1(cyclin.dependent kinase1,CDK1)siRNA、以及转染后进行凋亡刺激对细胞周期和凋亡的影响,探讨CDK1在细胞凋亡中的确切作用,揭示细胞周期与细胞凋亡协调的分子机制。方法以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,脂质体转染CDK1siRNA,转染后48h加紫杉醇(Tax01)(20μg/m1)刺激凋亡,Western印迹检测CDK1和抗凋亡蛋白BCL2表达,AnnexinV/PI法检测细胞的凋亡,流式细胞仪分析DNA含量检测细胞周期。结果转染CDK1 siRNA后,CDK1蛋白的表达下降,细胞周期G2/M期比例增加,细胞凋亡率与对照相比没有明显升高。只加Taxol刺激12h后细胞凋亡率增加并伴有S期和G2/M期比例增加。转染CDKlsiRNA后再用Taxol刺激,其细胞凋亡率没有明显改变,G2/M期阻滞效应也没有叠加。BCL2蛋白只在加Taxol刺激组表达下降,与CDK1表达减少没有相关性。结论siRNA沉默导致的CDK1表达降低只导致细胞周期G2/M期阻滞,没有引起细胞凋亡;CDK1的表达降低对紫杉醇所诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡效应没有明显影响。  相似文献   

7.
PI3K-Akt信号传导通路对糖代谢的调控作用   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)作为酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的主要下游分子,通过催化产生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)并激活Akt、糖原合酶激酶-3(GSK-3)、Forkhead转录因子FoxO1、mTOR(mammalian target of rapamycin)等下游分子,将多种生长因子及细胞因子的信号传递到细胞内,从而对细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种生物过程起重要的调节作用.PTEN(phosphatase and tensin homologue)是PI3K信号通路的重要负调节因子.本文将对PI3K-Akt信号通路在糖代谢中的作用予以简要综述.  相似文献   

8.
骨骼肌细胞的凋亡   总被引:4,自引:0,他引:4  
细胞凋亡是受基因调控的细胞死亡方式,与机体组织的萎缩和退化关系密切,近年来有人将骨骼肌的萎缩和退化与细胞凋亡联系起来,认为细胞凋亡可能在骨骼肌萎缩和退化中发挥重要作用,本文综述了近年来对骨骼肌肌肉细胞和未分化肌细胞的凋亡及其基因调控的研究,以期进一步阐明骨骼肌萎缩和退化的发生机制,为临床上寻找延缓骨骼肌萎缩的治疗方法提供一些思路。  相似文献   

9.
应用Tet-On基因表达系统,调控CYP2E1基因在NIH 3T3细胞中的表达水平,探讨CYP2E1在化学致癌物二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)代谢中的作用.先后将 Tet-on基因表达系统的调控质粒pRevTet-on和反应质粒pRevTRE-2E1转染NIH 3T3细胞,分别用G418和潮霉素筛选,并通过RT-PCR和Western印迹检测,成功获得了3个具有良好诱导性Tet调控的CYP2E1基因表达细胞系(Tet/3T3-2E1).应用不同浓度强力霉素(doxycycline, Dox)处理Tet/3T3-2E1细胞诱导CYP2E1表达,HPLC分析细胞对CYP2E1特异性药物探针氯唑沙腙的原位代谢能力及MTT法分析CYP2E1介导的NDMA细胞毒性作用.结果显示,Tet/3T3-2E1细胞CYP2E1的表达及其代谢能力有明显的Dox浓度依赖性,而且NDMA对Dox诱导组细胞有明显浓度依赖性细胞毒性作用,其IC50值为12.06 μmol/L,无Dox诱导组未见明显的NDMA细胞毒性作用.该细胞模型的成功建立对于开展与CYP2E1相关的毒物、致癌物代谢研究,筛选抗毒物、抗癌物等具有重要价值.  相似文献   

10.
将含有RA538的真核表达载体pCDV1与含neo基因的表达载体pDOR-neo经Lipofectin法共转染到人食管癌细胞系EC8712,EC109细胞,结果表明:RA538的表达对两细胞系均有很强的生长抑制作用,引起细胞形态的明显改变,诱发细胞终末分化与死亡。RT-PCR分析发现,RA538的表达激活了谷氨酰胺转移酶(transglutaminase,TGase)基因的表达,引起c-myc基因表达下降,被膜素(involu-crin)基因表达增加.而对TGF-β基因的表达没有明显的影响.应用凋亡细胞原位检测法证实,RA538表达诱发的细胞死亡是通过细胞凋亡而实现的.以上结果与直接用维甲酸处理人食管癌细胞后所得结果相似 因此认为:RA538是维甲酸诱导人食管癌细胞发生终末分化和凋亡过程中一系列被激活基因中的1个关键基因.  相似文献   

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