猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus type III,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436bp)、PCV3 Cap基因(619bp)和SIV M基因(199bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type II,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirus II,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirus III,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。     

猪PEDV与PDC_OV二重RT-PCR检测方法的建立

旨在建立能同时检测出猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪丁型冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCOV)的二重RT-PCR检测方法。根据GenBank已收录发表的PEDV和PDCOV基因序列设计2对特异性引物,首先运用RT-PCR反应技术,通过PEDV和PDCOV病毒的目的基因的单项扩增,对反应条件进行优化。然后通过特异性试验、敏感性试验以及临床样品的检测验证确定二重RT-PCR方法的建立。结果显示,目的基因PEDV-M扩增的片段大小是750 bp,PDCOV-N扩增的片段大小是372 bp;能够同时检测出PEDV和PDCOV目的基因,却检测不到PRV、CSFV、PPV三种病毒;体系优化扩增PEDV-PDCOV混合核酸浓度下限为100 pg/μL;能够初步诊断出临床疑似病毒感染的病例。结果表明,成功的建立PEDVPDCOV二重RT-PCR检测方法,此方法敏感性高、特异性强,是一种能够快速有效的检测出猪PEDV-PDCOV单病毒感染或多病毒混合感染的临床诊断方法。     

套式RT-PCR检测猪繁殖和呼吸综合征病毒的研究

参照ATCC VR-2332株及LV株保守区段设计了3条引物,以此建立了检测猪繁殖和呼吸综合征病毒的套式RT-PCR方法。利用其分别对ATCC VR-2332株、LV株及B13株进行套式RT-PCR,结果从3个不同地区分离的毒株中均能特异性的扩增出相应的片段,大小分别约为430bp(预期片段为430bp)、410bp(预期片段为413bp)及410bp(预期片段为413bP),而3个非PRRSV的病毒(猪瘟病毒、细小病毒及伪狂犬病毒)均未扩增出相应的片段。其敏感性可达到10^-2TCI     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立

采用猪瘟病毒野毒珠(CSFV39)感染猪肾传代细胞系PK-15,经连续传79代,建立了稳定的病毒持续感染细胞模型,获得CSFV39-PK15细胞株.用免疫荧光、RT-PCR检测、透射电镜跟踪观察了CSFV39-PK15细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况.结果表明第9,29,79代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特征.这为深入研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础.     

猪源胰酶中特异病毒和非特异病毒安全检测

目的:对猪源胰酶样品进行病毒检测,以评价其病毒安全性。方法:非特异性病毒检测采用致细胞病变、血凝吸附试验和形态学检测方法;特异性病毒检测包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性核酸检测,以及CSFV、PPV、PRV特定性抗原蛋白直接免疫荧光检测。结果:受检样品非特异性病毒检测中,未见可观察到的细胞病变产生和病毒粒子,对豚鼠、鸡和人的O型红细胞无凝集现象。特异性病毒检测中,PRRSV、CSFV、PCV、PPV、FMDV和PRV核酸检测均为阴性,CSFV、PPV、PRV免疫荧光检测均为阴性。结论:猪源胰酶样品经非特异性病毒检测和特异性病毒检测均无可检出的病毒存在。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种毁灭性传染病,给养猪业造成重大经济损失。猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)是一株非常安全、有效的优秀弱毒疫苗,对各年龄和品种的猪都极其安全,同时对不同基因亚型的CSFV均能提供有效的免疫保护。在现地,CSFV和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的现象时常发生,有必要研制针对这两种病毒混合感染的二价疫苗。本研究首次构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组C株,并评价了其在体内外的特性。结果表明,该重组病毒与C株具有相近的体外增殖特征,能够稳定表达Cap蛋白,在家兔体内具有与C株相似的生物学表型,在免疫家兔后10 d,抗CSFV E2抗体全部转阳,然而抗Cap抗体未能转阳。本研究为进一步优化表达PCV2Cap蛋白的重组C株奠定了基础。     

茎环法RT-qPCR定量检测细胞抗猪瘟病毒siRNA的表达

RNAi(RNA interference)已成为特异抗病毒治疗研究的热点,但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siN1和siN2)在细胞中的表达水平,设计并以交叉组合方法筛选了具有较高特异性和灵敏度的siRNA特异茎环引物(SLP-N1-6和SLP-N2-8),成功地建立了最优的siN1和siN2的茎环法RT-qPCR检测方法。该方法表现出良好的特异性和较高的灵敏度,能检测出102至108个拷贝的siRNA,至少可达7个数量级的检测范围,平行性好(Rsq=0.999),扩增效率高(Eff.=98.2%)。茎环法RT-qPCR能准确地定量检测抗CSFV的PK-15细胞克隆的siN1/siN2表达水平,可结合常规的检测病毒水平的间接免疫荧光和TCID50等技术定量评价RNAi抗CSFV的有效性,为未来抗猪瘟转基因猪的抗病毒效果评价提供了先进的检测技术。     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、581bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10-6.2、10-3.8、10-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和盖他病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

盖他病毒(Getah virus,GETV)可感染猪并引起和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)相类似的临床表现,且两者可混合感染而难以区分。我国检测PRRSV和其他诸多病毒的多重PCR文献已比比皆是,但尚无同时检测PRRSV和GET V方法的报道。为此,作者根据GenBank中公布的PRRSV和GETV全基因序列,设计了两对分别扩增PRRSV ORF7基因和GETV Cap基因片段的引物,通过反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,首次建立了可同时检测PRRSV和GETV的双重RT-PCR方法。结果显示,该方法可以同时扩增出PRRSV 633 bp和GETV 316 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒等其他相关病毒扩增结果均为阴性。对GETV和PRRSV的cDNA最低检测量分别为2.48×10~(-4)ng和2.50×10~(-5)ng。用建立的双重RTPCR方法对河南15个地市92个猪场的136份临床疑似PRRS发病猪样品进行检测,共从58个猪场检出PRRSV单一阳性样品44份,阳性率为32.4%;GETV单一阳性样品7份,阳性率为5.15%;GETV和PRRSV混合感染样品8份,阳性率为5.88%。检测结果与单一RT-PCR结果吻合率达100%。该方法为GETV和PRRSV的快速检测、鉴别诊断和分子流行病学研究等提供了新的技术手段。     

基于宏基因组学的猪群样本病毒探测方法的建立

极其多样的病毒广泛存在于我们周围的环境和动物体内,其中很多病毒是人类所未知的,而发现未知病毒常常受制于病毒常规检测技术的局限性.[目的]构建未知病毒检测技术平台.[方法]应用病毒宏基因组学的理念,结合新型分子诊断技术,首先利用过滤和核酸酶处理去除样品宿主核酸干扰,然后随机PCR扩增潜在的病毒宏基因组,最后通过大规模测序及序列分析获取病毒核酸信息.[结果]利用此技术我们对猪瘟病毒(CSFV)细胞培养物和猪圆环病毒2型(PCV2)感染猪病料进行了分析,分别检测到序列总长度1680 bp,占基因组13.7％的CSFV序列和序列总长度834 bp,占基因组47.2％的PCV2序列;利用此检测技术平台研究一未知病原细胞培养物,通过测序和序列分析,结果显示56条序列中有26条为副流感病毒5型(PIV5)同源序列,覆盖了其基因组全长的16.4％;此外,应用本研究建立的方法结合新一代高通量测序,我们在混合的7份病原未知的病猪组织样品中检测到了1.1％的病毒序列,包括CSFV、PCV2、猪细环病毒(TTSuV)、猪bocavirus (PBoV)和人腺病毒6型(Ad6)等的部分基因序列.[结论]本研究建立的基于病毒宏基因组学的未知病毒的检测方法突破了传统病毒研究方法的缺陷,对于猪群样本中病毒的检测具有较高的敏感性,有望为新发、突发感染性疾病的诊断和监测提供技术支持.     

鸭圆环病毒与鸭Ⅰ型肝炎病毒二重 PCR 检测方法的建立

目的：建立一种同时检测鸭圆环病毒（DuCV）和鸭I型肝炎病毒（DHV）病原体的二重PCR技术。方法：根据DuCV和DHV的基因文库,分别设计了2对与DuCV和DHV某段基因序列互补的引物,用这2对引物对同一样品中DuCV和DHV模板进行二重PCR扩增。结果与结论：用建立的方法均同时得到了2条特异性的大小与实验设计相符（DuCV：245bp;DHV：569bp）的二重PCR扩增带,而且对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性,能同时检出56Pg的DHVRNA模板和6Pg的DuCVDNA模板。     

Detection of porcine parvovirus using a taqman-based real-time pcr with primers and probe designed for the NS1 gene

A TaqMan-based real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was devised for the detection of porcine parvovirus (PPV). Two primers and a TaqMan probe for the non-structural protein NS1 gene were designed. The detection limit was 1 x 102 DNA copies/μL, and the assay was linear in the range of 1 x 102 to 1 x 10? copies/μL. There was no cross-reaction with porcine circovirus 2 (PCV2), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), pseudorabies virus (PRV), classical swine fever virus (CSFV), or Japanese encephalitis virus (JEV). The assay was specific and reproducible. In 41 clinical samples, PPV was detected in 32 samples with the real-time PCR assay and in only 11 samples with a conventional PCR assay. The real-time assay using the TaqMan-system can therefore be practically used for studying the epidemiology and management of PPV.     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、细小病毒（PPV）、及伪狂犬病毒（PRV）疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp（PCV2）、581bp（PPV）、372bP（PRV gB）及147bp（PRV gE）四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10^-6.2、10^-3.8、10^-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用

根据基因库中对虾桃拉综合征病毒（TSV）、白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT—PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT—PCR。该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp（TSV）、593bp（WSSV）和356bp（IHHNV）的特异性多重RT—PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pgTSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA。临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和I—HHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

马传染性贫血病毒美洲流行株与我国弱毒疫苗株鉴别诊断方法的研究

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是反转录病毒科慢病毒属的成员,是马传染性贫血病的病原。二十世纪七十年代我国就研制出马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗,成为世界第一个成功地应用该疫苗控制了我国的马传贫的发生[1]。而且我国的马传贫弱毒疫苗对异源的美国、古巴和阿根廷等毒株也有很高的保护率[2]。因此将我国的马传贫驴细胞弱毒疫苗推向国际市场成为可能。然而目前制约该苗出口的技术问题是现行的OIE推荐的琼脂扩散实验和ELISA等血清学方法不能鉴别自然感染马与我国弱毒疫苗免疫马,针对这个关键问题,本试验…     

Diagnosis of Penaeus monodon-type baculovirus by PCR and by ELISA of occlusion bodies

The black tiger prawn Penaeus monodon is a valuable aquaculture product in Taiwan. Two specific diagnostic methods were established for P. monodon-type baculovirus, one using polymerase chain reaction (PCR) technology and the other enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technology. Monodon-type baculovirus (MBV) was purified by sucrose gradient centrifugation from occlusion bodies of MBV-infected postlarvae of P. monodon. MBV DNA was subsequently purified from the occlusion bodies and its presence was confirmed by PCR using primers of the polyhedrin gene. Based on conserved sequences of the DNA polymerase genes of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) and Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus (LdMNPV), primers were designed and synthesized to yield a 714 bp PCR fragment from MBV. However, the sequence of this fragment revealed low homology with that of LdMNPV and AcMNPV. From the DNA sequence of this fragment, a second set of primers was designed, and using these primers, a 511 bp DNA fragment was amplified only when MBV DNA was the template. DNA templates from AcMNPV, white spot syndrome diseased shrimp, or PMO cells (a cell line derived from the Oka organ of Penaeus monodon) did not give any amplified DNA fragment. Therefore, this primer pair was specific for the diagnosis of MBV. By using intraspleenic immunization of rabbits with purified MBV occlusion bodies, a polyclonal rabbit antiserum against MBV was obtained. This antiserum could detect nanogram levels of MBV, but did not cross react with white spot syndrome virus (WSSV), homogenates of PMO cells, postlarvae, hepatopancreatic tissue or intestinal tissue of black tiger prawns by competitive ELISA. This sensitive method could detect MBV even in tissue homogenates.     

多重PCR快速确证外源基因在转基因小麦后代的传递

根据转入小麦0世代中的高分子谷蛋白亚基1Dx5基因和报告基因uidA、作为选择标记的除草剂抗性基因bar的序列,设计合成三对引物。以整合uidA+bar的质粒pAHC25和整合1Dx5的质粒p1Dx5为模板寻找uidA与1Dx5及或bar多重扩增的最佳模板浓度及最适退火温度。MPCR模板量是单对引物扩增时的两倍,引物浓度同常规PCR为0.3μM,uidA与bar的适宜退火温度范围为57.1 - 62.3℃;uidA与1Dx5为60.0℃-60.6℃;uidA、bar、1Dx5的最适合退火温度范围为57.0℃-58.4℃。MPCR对大小相差50bp及以下的多重扩增片段可通过10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在此基础上对14株T1代转基因小麦基因组DNA进行多重PCR扩增,筛选出基因未分离的小麦后代,并与常规PCR比较,结果一致,其中11株同时传递1Dx5和bar基因、1株同时传递uidA、bar和1Dx5基因,3株未检测到外源基因。表明MPCR在快速确证外源基因在转基因植株后代的传递中作用显著。研究在常规PCR反应体系上,对模板浓度和多重引物退火温度进行微调,且把MPCR技术与PAGE技术结合起来,提高了研究结果的准确性,获得了较好的扩增和检测效果,简化了MPCR优化程序,使MPCR的优势更明显,为该技术的广泛应用提供了借鉴。     

五种主要上呼吸道病毒多重RT-PCR 检测方法的建立

目的:建立甲型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、B型(RSV-A、RSV-B)和腺病毒(ADV)五种主要上呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法。方法:利用Primer premier5.0分别针对甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的PB1基因、RSV-A和RSV-B的F基因及ADV的hexon基因设计五对特异性引物,对Mg2+、dNTP、引物浓度及退火温度等进行优化,建立同时检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV的多重RT-PCR方法,并验证该检测方法的灵敏性。结果:所建立的五种病毒的多重RT-PCR方法可以同时或者分别扩增甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B及ADV的141bp、635bp、525bp、377b和283bp基因片段,敏感度分别达到770PFU/ml、800PFU/ml、680PFU/ml、970PFU/ml和850PFU/ml,且五种病毒间无交叉反应。结论:所建立的多重RT-PCR方法可以迅速准确地检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV,为五种病毒的检测提供了一种方便易行的方法。     

猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征混合感染的快速检测及地域流行性分析

呼吸道和繁殖障碍疾病是猪场最常见的两种疾病,严重影响猪群的健康和正常生产,已经给世界养猪业造成了很大的经济损失。而且这两种疾病的病原复杂多样,不同的猪场病因可能完全不同,从而给疾病的诊断与防治带来了极大的困难。多年的研究表明,呼吸道和繁殖障碍疾病的病原包