HOXA-AS2靶向miR-17对人脐静脉内皮细胞生物学功能以及炎症因子的影响

目的探讨HOXA-AS2对动脉粥样硬化（AS）模型细胞生物学功能以及炎症因子的影响及分子机制。 方法本实验共分为4个实验;实验1：用100 μg/mL的ox-LDL处理EA.hy926细胞作为ox-LDL组,正常培养的细胞作为对照组;实验2：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2转染至EA.hy926细胞中再用100 μg/mL的ox-LDL处理,记为ox-LDL+pcDNA3.1组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组;实验3：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2、si-NC、si-HOXA-AS2分别转染至EA.hy926细胞中,记为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-HOXA-AS2组、si-NC组、si-HOXA-AS2组;实验4：将pcDNA3.1-HOXA-AS2与miR-NC、miR-17分别共转染至EA.hy926细胞中再用100 μg/mL的ox-LDL处理,记为ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组。实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测HOXA-AS2和miR-17的表达水平;蛋白质印迹（Western blot）法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A （P21）、cleaved caspase 3蛋白表达;MTT检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测白细胞介素-1 （IL-1）、白细胞介素-6 （IL-6）水平;荧光素酶报告实验检测HOXA-AS2和miR-17的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与对照组比较,ox-LDL组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平（0.23±0.02比1.02±0.10）,细胞增殖率[（47.83±5.01）﹪比（100.06±10.20）﹪]均降低,细胞凋亡率[（26.81±2.47）﹪比（8.23±0.80）﹪]、P21 （0.82±0.08比0.20±0.02）、cleaved caspase 3 （0.67±0.06比0.14±0.01）、IL-1[（792.34±59.37）ng/L比（326.14±34.59） ng/ L]和IL-6表达水平[（53.67±4.65）ng/L比（19.25±2.11）ng/L]均升高,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与ox-LDL+pcDNA3.1组比较,ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平（0.87±0.09比0.22±0.02）、细胞增殖率[（89.94±8.34）﹪比（48.21±4.86）﹪]均升高,细胞凋亡率[（12.33±1.18）﹪比（26.83±2.48）﹪]、P21 （0.33±0.03比0.81±0.08）、cleaved caspase 3 （0.24±0.02比0.69±0.06）、IL-1[ （446.25±46.84）ng/L比（802.21±60.18）ng/L]和IL-6表达水平[（25.64±2.65）ng/L比（55.21±5.10）ng/L]均降低,差异具有统计学意义（P均< 0.001）。与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组比较,ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组EA.hy926细胞中miR-17表达水平（2.14±0.21比1.05±0.10）、细胞凋亡率[（23.31±2.33）﹪比（13.75±1.44）﹪]、IL-1水平[（684.26±62.38）ng/L比（451.21±43.58）ng/L]、IL-6水平[（41.29±4.37）ng/L比（26.11±2.39）ng/L]均升高,细胞增殖率[（53.67±5.46）﹪比（90.21±9.16）﹪]降低,差异具有统计学意义（P均< 0.001）。HOXA-AS2与miR-17存在结合位点,荧光素酶报告实验显示,与miR-NC组比较,miR-17组中转染WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性降低（0.33±0.03比1.01±0.10,P < 0.05）,而转染MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）;与anti-miR-NC组比较,anti-miR-17组中转染WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性升高（2.29±0.21比1.00±0.10,P < 0.05）,而转染MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论过表达HOXA-AS2促进细胞增殖,抑制ox-LDL引起的细胞凋亡和炎症因子的释放,其机制可能与miR-17有关。     

源自天蚕素A和爪蟾素2的杂合肽P18体外抑制内皮细胞血管生成

目的探讨杂合肽P18体外对内皮细胞EA.hy926血管生成的抑制作用.方法采用MTT法检测P18对EA.hy926细胞增殖的影响;应用Matrigel实验检测P18对内皮细胞形成管状结构的影响;利用流式细胞术分析P18对内皮细胞的损伤作用.结果 MTT结果显示P18可明显抑制EA.hy926细胞的增殖,且抑制率存在剂量依赖性;Matrigel实验表明P18具有抑制EA.hy926细胞体外分化成管状结构的作用;流式结果显示15 μM P18作用内皮细胞6 h后,所诱导的细胞坏死比例达到81.4%.结论体外实验结果表明,杂合肽P18具有体外抑制EA.hy926细胞血管生成的作用.     

厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926增殖、凋亡、VEGF mRNA表达的影响

目的:应用不同浓度厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy 926的增殖、凋亡生物学效应及血管发生主要基因VEGFmRNA的表达进行体外研究,探讨厄贝沙坦对内皮细胞的血管生成效应。方法:各种浓度厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926共同孵育24 h。细胞增殖采用CCK8法分析,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。RT-PCR验证VEGFmRNA的表达。结果:厄贝沙坦各浓度干预组细胞形态无明显变化,CCK8结果提示厄贝沙坦各干预组相比对照组细胞增殖活力增高(P<0.05),呈浓度非依赖性。流式细胞仪分析厄贝沙坦各浓度干预组细胞无明显凋亡。RT-PCR发现厄贝沙坦1×10-4,1×10-5,1×10-6mol/L浓度组VEGFmRNA表达增高(P<0.05)。结论:厄贝沙坦促进EA.hy926细胞株细胞增殖,上调VEGFmRNA的表达。这提示除了降压效应,血管紧张素受体拮抗剂在缺血性心脏病如慢性心力衰竭治疗中具有一定作用。     

一种大容量细胞灌流液中外泌体的提取方法及鉴定*

目的: 建立一种从大容量细胞灌流液中提取外泌体的方法,并进行外泌体的鉴定。方法: 人脐静脉内皮细胞株(EA.HY926)是人脐静脉内皮细胞和人肺腺癌细胞株A549杂交成的永生化细胞株,因其具有血管内皮细胞的特性,广泛用于内皮细胞相关研究。本研究采用含10%胎牛血清的M199培养基培养,利用Flexcell STR-4000平行板流室系统对EA.HY926施以振荡剪切应力。收集流体剪切应力处理后的细胞灌流液,去除细胞碎片后冻成干粉,脱盐、提取纯化外泌体。电镜观察外泌体形态、纳米粒径电位分析仪检测外泌体大小、PKH26染色检测外泌体膜性结构、BCA蛋白定量法检测外泌体的蛋白浓度、Western blot检测外泌体特异性蛋白CD9和CD81的表达,荧光定量RT-PCR检测内皮细胞相关基因的表达。结果: 该方法提取的外泌体,大小均一,结构完整,呈典型囊泡样结构;粒径集中在30~150 nm,多数粒径为97.63 nm;表达外泌体特异性蛋白CD9和CD81;PKH26染色阳性,并可被细胞摄取;EA.HY926分泌的外泌体表达内皮细胞相关的CD31、vWF等mRNA,以及miR-126、miR-21、miR-155等microRNA分子。结论: 本方法能够有效从大容量细胞灌流液中提取到结构完整的、高浓度、高质量的外泌体,为开展以流体力学干预细胞为基础的外泌体相关研究提供技术方法。     

LncRNA AC130710通过miR-129-5P/WNT4轴促进子宫内膜癌细胞增殖和上皮间质转化

目的探讨LncRNA AC130710通过miR-129-5P/WNT4轴对子宫内膜癌细胞（HEC-1A细胞）增殖、凋亡及上皮间质转化（EMT）的影响及机制研究。 方法通过实时荧光定量PCR检测LncRNA AC130710、miR-129-5P和WNT4在子宫内膜癌细胞（HEC-1A细胞）和人子宫内膜上皮细胞（HEEC）中的表达。细胞分别转染（1）siRNA NC、AC130710 siRNA、WNT4 siRNA;（2）inhibitor NC、miR-129-5P inhibitor;（3）pcDNA-3.1 （+）+mimics NC、pcDNA-AC130710+mimics NC、pcDNA-3.1 （+）+miR-129-5P mimics、pcDNA-AC130710+miR-129-5P mimics。MTT实验检测LncRNA AC130710、miR-129-5P和WNT4的表达对HEC-1A细胞增殖能力的影响;Western blot检测LncRNA AC130710、miR-129-5P和WNT4的表达对HEC-1A细胞凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因相关蛋白X （Bax）、剪切的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3 （cleaved caspase-3）、cleaved caspase-9和B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）表达的影响;Western blot检测LncRNA AC130710、miR-129-5P和WNT4的表达对HEC-1A细胞EMT的影响。miRanda和双荧光素酶报告基因实验分析LncRNA AC130710和miR-129-5P之间的关系,TargetScan数据库分析miR-129-5P与WNT4的相关性,双荧光素酶报告基因检测miR-129-5P与WNT4的相互作用;RT-qPCR法检测LncRNA AC130710通过miR-129-5P对WNT4表达的影响。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。 结果与HEEC细胞比较,HEC-1A细胞中AC130710表达水平（1.86±0.21比0.85±0.06）、WNT4表达水平（1.88±0.26比1.08±0.12）升高;HEC-1A细胞中miR-129-5P表达水平（0.89±0.16比1.76±0.08）降低。与转染siRNA NC比较,转染AC130710 siRNA细胞内Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、E-cadherin蛋白相对表达水平[（1.37±0.14比0.84±0.21）,（1.08±0.16比0.37±0.07）,（1.26±0.24比0.39±0.06）,（1.87±0.17比1.32±0.26）]上升,Bcl-2、N-cadherin、Snail和Vimentin蛋白相对表达水平[（0.38±0.08比1.18±0.14）,（0.36±0.04比0.85±0.24）,（0.35±0.09比1.12±0.18）,（0.42±0.10比1.26±0.27）]下降;与转染inhibitor NC比较,转染miR-129-5P inhibitor细胞的Bcl-2、N-cadherin、Snail和Vimentin蛋白相对表达水平[（0.98±0.07比0.65±0.08）,（1.39±0.15比0.68±0.09）,（0.95±0.08比0.42±0.06）,（1.16±0.16比0.54±0.02）]上升,Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、E-cadherin蛋白相对表达水平[（0.27±0.09比0.85±0.13）,（0.48±0.05比1.16±0.28）,（0.52±0.14比1.19±0.15）,（0.43±0.09比1.08±0.26）]下降;与转染siRNA NC比较,转染WNT4 siRNA细胞的Bcl-2、N-cadherin、Snail和Vimentin蛋白相对表达水平[（0.23±0.08比0.84±0.12）,（0.28±0.09比1.14±0.17）,（0.42±0.23比1.06±0.15）,（0.35±0.08比1.13±0.08）]降低,Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、E-cadherin蛋白相对表达水平[（0.96±0.12比0.42±0.08）,（1.13±0.25比0.45±0.06）,（1.54±0.23比0.72±0.12）,（1.87±0.24比1.26±0.18）]上升。 结论LncRNA AC130710可通过miR-129-5P/WNT4轴调控子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、凋亡及EMT。     

慢病毒介导的稳定表达人GM-CSF、IL-4的EA.hy926细胞株的建立

目的:获得能够稳定表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的内皮细胞株。方法:构建重组慢病毒表达载体,在293FT细胞中进行病毒的包装,用获得的高滴度慢病毒感染EA.hy926细胞株,建立能够稳定、高效表达hGM-CSF、hIL-4的EA.hy926细胞株。结果:EA.hy926感染效率达90%以上,长期传代后阳性率仍维持在90%以上;实时定量PCR和ELISA方法证实感染后细胞hGM-CSF、hIL-4在mRNA水平的表达分别是未感染细胞的25倍和9946倍,在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的145倍和23倍。结论:构建的细胞系可以稳定表达细胞因子GM-CSF、IL-4。     

miR-106a-5p调控 PTEN对鼻咽癌细胞SUNE2增殖和迁移的抑制作用研究

目的研究miR-106a-5p对鼻咽癌细胞SUNE2增殖和迁移的影响。 方法将体外培养的鼻咽癌细胞SUNE2分成对照组（细胞未做任何处理）、Anti-NC组（转染阴性对照抑制剂）、Anti-miR-106a-5p组（转染miR-106a-5p抑制剂）、后期实验另设Anti-miR-106a-5p-inhibitor+si-NC组（转染miR-106a-5p抑制剂、siRNA阴性对照）、Anti-miR-106a-5p-inhibitor+si-PTEN组（转染miR-106a-5p抑制剂、PTEN siRNA）,采用Realtime PCR测定miR-106a-5p表达,MTT法检测增殖,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力变化,用Western blot方法测定vimentin、E-cadherin蛋白表达。在线靶基因预测软件预测miR-106a-5p的靶基因可能为PTEN,双荧光素酶报告系统鉴定miR-106a-5p和PTEN的靶向关系。两组间比较用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与正常鼻咽上皮细胞NP69比较,鼻咽癌细胞CNE-2、HK1、SUNE2中miR-106a-5p水平（1.00±0.11比1.84±0.13、2.19±0.14、2.87±0.25）升高,差异具有统计学意义（P < 0.05）。与对照组、Anti-NC组比较,Anti-miR-106a-5p组鼻咽癌细胞miR-106a-5p水平（1.00±0.10、0.99±0.12比0.76±0.08）降低,OD值（0.56±0.05、0.57±0.04比0.32±0.02）,细胞侵袭数[（128.47±11.65）个、（129.84±10.93）个比（85.12±6.75）个],迁移数[（182.51±14.81）个、（180.68±17.64）个比（122.01±11.62）个],vimentin蛋白表达水平（0.84±0.09、0.82±0.07比0.30±0.05）降低,E-cadherin蛋白表达水平（0.29±0.04、0.28±0.05比0.76±0.08）升高,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与Anti-miR-106a-inhibitor+si-NC组比较,Anti-miR-106a-inhibitor+si-PTEN组细胞OD值（0.33±0.03比0.52±0.05）、侵袭数[（84.16±5.91）个比（105.79±8.63）个]、迁移数[（118.42±10.25）个比（164.28±12.05）个]、vimentin蛋白表达水平（0.34±0.06比0.68±0.05）均升高,E-cadherin蛋白表达水平（0.72±0.06比0.29±0.05）降低,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。 结论miR-106a-5p可通过靶向调控PTEN抑制鼻咽癌细胞SUNE2增殖和迁移潜能。     

人嗅觉黏膜间充质干细胞来源的外泌体促进内皮细胞的血管生成

外泌体作为是细胞旁分泌的重要介质,在促血管形成方面有重要作用。在我们前期研究中,已经成功从嗅黏膜间充质干细胞（olfactory mucosa mesenchymal stem cells,OM-MSCs）分离、鉴定了其外泌体,然而,OM-MSCs源外泌体对血管生成的影响尚不清楚。本研究旨在探讨OM-MSCs来源外泌体对内皮细胞血管生成能力的影响。采用PKH67 荧光标记OM-MSCs源外泌体,与人脑微血管内皮细胞（human brain microvessel endothelial cells, HBMECs) 共培养,观察 OM-MSCs外泌体能否进入 HBMECs。采用CCK-8法、Transwell 迁移实验和小管实验,观察 OM-MSCs外泌体对 HBMECs增殖、迁移及管状结构形成的影响。采用基质胶塞实验及CD31免疫荧光,观察OM-MSCs外泌体在体内对血管生成的影响。上述研究均以等量 PBS 作为对照。结果提示,OM-MSCs外泌体可被HBMECs 摄取。CCK-8 法检测显示,在处理1、2、3、4、5 d各时间点,实验组细胞增殖均优于对照组（1.32±0.14 vs. 0.98±0.04, 1.36±0.14 vs.1.04±0.06, 1.75±0.18 vs.1.33±0.11, 2.16±0.11 vs.1.50±0.19, 2.71±0.11 vs. 1.81±0.20, P<0.01）。Transwell 实验结果显示,实验组跨膜迁移细胞吸光度值较对照组显著增多（1.12±0.05 vs.0.02±0.02, P<0.05）。在体外小管实验中,从节点、交叉点、网眼数、血管分支数和总长度5个方面,实验组均高于空白对照组（374.33±127.74 vs. 193.33±44.79, 104.56±33.07 vs. 54.33±11.65, 20.11±11.20 vs. 7.56±3.64, 81.67±19.07 vs. 57.00±13.02, 11466.22±2781.03 vs. 8544.00±1848.61, P<0.05）;在体内实验中,实验组成血管及CD31阳性率（%）亦显著高于对照组（85.00±5.57 vs.8.00±2.08, P<0.05）。本研究表明：OM-MSCs外泌体可促进 HBMECs 增殖、迁移及管样结构形成,提示OM-MSCs外泌体可促进血管新生。     

人嗅觉黏膜间充质干细胞来源的外泌体促进内皮细胞的血管生成

外泌体作为是细胞旁分泌的重要介质,在促血管形成方面有重要作用。在我们前期研究中,已经成功从嗅黏膜间充质干细胞（olfactory mucosa mesenchymal stem cells,OM-MSCs）分离、鉴定了其外泌体,然而,OM-MSCs源外泌体对血管生成的影响尚不清楚。本研究旨在探讨OM-MSCs来源外泌体对内皮细胞血管生成能力的影响。采用PKH67 荧光标记OM-MSCs源外泌体,与人脑微血管内皮细胞（human brain microvessel endothelial cells, HBMECs) 共培养,观察 OM-MSCs外泌体能否进入 HBMECs。采用CCK-8法、Transwell 迁移实验和小管实验,观察 OM-MSCs外泌体对 HBMECs增殖、迁移及管状结构形成的影响。采用基质胶塞实验及CD31免疫荧光,观察OM-MSCs外泌体在体内对血管生成的影响。上述研究均以等量 PBS 作为对照。结果提示,OM-MSCs外泌体可被HBMECs 摄取。CCK-8 法检测显示,在处理1、2、3、4、5 d各时间点,实验组细胞增殖均优于对照组（1.32±0.14 vs. 0.98±0.04, 1.36±0.14 vs.1.04±0.06, 1.75±0.18 vs.1.33±0.11, 2.16±0.11 vs.1.50±0.19, 2.71±0.11 vs. 1.81±0.20, P<0.01）。Transwell 实验结果显示,实验组跨膜迁移细胞吸光度值较对照组显著增多（1.12±0.05 vs.0.02±0.02, P<0.05）。在体外小管实验中,从节点、交叉点、网眼数、血管分支数和总长度5个方面,实验组均高于空白对照组（374.33±127.74 vs. 193.33±44.79, 104.56±33.07 vs. 54.33±11.65, 20.11±11.20 vs. 7.56±3.64, 81.67±19.07 vs. 57.00±13.02, 11466.22±2781.03 vs. 8544.00±1848.61, P<0.05）;在体内实验中,实验组成血管及CD31阳性率（%）亦显著高于对照组（85.00±5.57 vs.8.00±2.08, P<0.05）。本研究表明：OM-MSCs外泌体可促进 HBMECs 增殖、迁移及管样结构形成,提示OM-MSCs外泌体可促进血管新生。     

苦荞麦总黄酮对PA诱导脐静脉内皮细胞DDAH_2表达的影响

观察苦荞麦总黄酮对软脂酸(PA)诱导的人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)中二甲基精氨酸二甲胺水解酶Ⅱ(DDAH2)表达等指标的影响,探讨苦荞麦总黄酮在胰岛素抵抗信号传导通路中的作用机制。将EA.hy926细胞株常规培养、传代,部分用600μmol/L PA造模后分为对照组、模型组、苦荞麦总黄酮组和二甲双胍组,苦荞麦总黄酮组进一步加入浓度为125 mg/L的苦荞麦总黄酮,二甲双胍组加入浓度为2 mmol/L的二甲双胍。双抗体夹心法测定ADMA含量;硝酸还原酶法测定NO含量;RT-PCR法测定DDAH2mRNA表达;Western-blot测定DDAH2蛋白表达。苦荞麦中、高剂量组与模型组比较,ADMA含量明显减少,NO含量明显增加,均有显著性差异(P0.05);苦荞麦总黄酮组与模型组比较,DDAH2mRNA和蛋白表达量增加,有显著性差异(P0.05)。苦荞麦总黄酮对于PA诱导下EA.hy926细胞中DDAH2、NO的合成具有明显促进作用,对ADMA的合成有明显抑制作用。     

Interleukin-1β enhances cell adhesion in human endothelial cells via microRNA-1914–5p suppression

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease and the underlying cause of most cardiovascular diseases. Interleukin (IL)-1β facilitates early atherogenic lesion formation by increasing monocyte adhesion to endothelial cells via upregulation of adhesion molecules, including intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). MicroRNAs (miRNAs) have been shown to be associated with inflammatory conditions in the vascular system. The expression of circulating miR-1914–5p is reportedly downregulated in patients with cardiovascular diseases. However, the role of miR-1914–5p downregulation in IL-1β–induced endothelial cell dysfunction and the effect of miR-1914–5p on lesion formation remain unclear. Therefore, we investigated whether miR-1914–5p is associated with monocyte adhesion in human endothelial cells. IL-1β decreased miR-1914–5p expression in EA.hy926 cells. In addition, miR-1914–5p depletion enhanced ICAM-1 expression and monocyte adhesion in EA.hy926 cells. Moreover, miR-1914–5p mimic suppressed monocyte adhesion and ICAM-1 expression induced by IL-1β in endothelial cells. These results suggest that suppression of miR-1914–5p expression by IL-1β may be an important regulator in mediating monocyte adhesion in endothelial cells. Further investigation of miR-1914–5p may lead to the development of novel therapeutic strategies for atherosclerosis.     

Variability in E-selectin expression, mRNA levels and sE-selectin release between endothelial cell lines and primary endothelial cells

Endothelial cell lines express markers and are assumed to exhibit other endothelial cell responses. We investigated E-selectin expression from human umbilical vein endothelial cells, the spontaneously transformed ECV304 line and the hybrid line EA.hy926 by flow cytometry and immunofluorescence, mRNA and soluble E-selectin release. In cells exposed to tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin-1beta (IL-1beta), median (range) percentage of E-selectin-positive HUVECs increased from 1.6(0.9-6. 2)% to 91.4(83.0-96.1)%, (P=0.001) using flow cytometry. In contrast, E-selectin expression by ECV304 and EA.hy926 cell lines was 100-fold lower. E-selectin mRNA was detectable after 2 h, maximal at 6 h in HUVECs and undetectable in EA.hy926 and ECV304 cell lines after exposure to TNF-alpha/IL-1beta. sE-selectin accumulation increased (P=0.004) in HUVECs only. Neutrophil adherence to ECV304 and EA.hy926 cells was poor compared to HUVECs (P=0.004). The cell lines ECV304 and EA.hy926 do not exhibit normal endothelium expression of E-selectin, and may not be appropriate for studies of adhesion.     

Influence of products of bacterial origin on the expression of surface molecules in monocyte-derived and endothelial cells

AIM: To study the influence of lypopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacterium (Escherichia coli O55:B5) and lysate of Gram-positive bacteria (Streptococcus pyogenes - group A, type M1, strain 40/58) on the level of expression of important surface molecules of monocyte-derived cells from continuous cell line THP-1 and endothelial cells from continuous cell line EA.hy 926. MATERIALS AND METHODS: Expression of surface molecules HLA-DR, CD11b, CD14, CD16, CD32, and CD54 was assessed using FITC- or PE-labeled monoclonal antibodies (Beckman Coulter, USA). Intensity of fluorescence was measured by flow cytometer Epics Altra manufactured by Beckman Coulter (USA). RESULTS: Studied components of Gram-positive and Gram-negative bacteria stimulated expression of CD14, CD16, CD32, and CD54 molecules on cells from THP-1 line; incubation of cells from EA.hy 926 line in the presence of the same bacterial components increased expression levels of CD54 and HLA-DR molecules. CONCLUSION: Endothelial cells of EA.hy 926 line was less sensitive to LPS of E. coli and lysate of S. pyogenes compared to monocyte-derived cells of THP-1 line. Usage of THP-1 cells allowed to reveal differences between effects of components of Gram-positive and Gram-negative bacteria. The stimulating effect of LPS was more pronounced compared to effect of S. pyogenes lysate in relation to expression of HLA-DR, CD11b, and CD54 molecules, whereas lysate of S. pyogenes better stimulated expression of CD14, CD16, and CD32 molecules.     

Estrogen modulation of endothelium-derived relaxing factors by human endothelial cells

We report the modulatory effects of estrogen on release of endothelium-derived relaxing factors (EDRFs) in a human endothelial cell line, EA.hy926. Using bioassay, we showed that EA.hy926 released EDRF including nitric oxide (NO) and endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) measured by relaxation of pre-contracted endothelium-denuded rabbit aortic rings. This EDRF production was significantly higher in cells treated for 24 h with 17-beta-estradiol (10(-6)mol/L) than control cells. Addition of L-NAME to the perfusate of cells caused the relaxation induced by the endothelial cell perfusate to become transient and abolished the enhancement of relaxation due to estrogen treatment. Addition of K(Ca) channel blockers to the perfusate abolished the L-NAME-resistant relaxation of the bioassay ring. Using real-time PCR, we demonstrated that eNOS expression in estrogen-treated cells was significantly higher than controls. These results show that estrogen exerts a potentially important vasculo-protective effect by stimulating NO but not EDHF production.