pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响

为研究pcsk9基因沉默后对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响,用不同浓度oxLDL 处理THP-1源性巨噬细胞48 h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot分别检测pcsk9 mRNA、NARC-1蛋白的表达．应用Lipofectamine2000转染3对pcsk9 siRNAs进THP-1源性巨噬细胞中,筛选出最有效的siRNA再转染入THP-1源性巨噬细胞,24 h后加入oxLDL处理 48 h,Hoechst33258染色观察细胞评价细胞凋亡,流式细胞术计数检测细胞凋亡率．结果发现,75 mg/L oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h后,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞．同时RT-PCR、Western blot检测发现,pcsk9 mRNA和NARC-1蛋白质表达量均随oxLDL浓度的增加而增加,75 mg/L oxLDL组增加最明显．不同浓度siRNA转染THP-1源性巨噬细胞后,RT-PCR筛选出3对siRNAs的终浓度为80 nmol/L均可出现明显的沉默效应．选取此浓度在蛋白质水平检测基因抑制情况,筛选出最有效的一对siRNA．将筛选出来的siRNA转染细胞24 h后,再用oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示,转染siRNA组凋亡明显被抑制．结果表明,在本研究的浓度范围内,随着oxLDL浓度增加pcsk9的表达随之增加,同时,THP-1源性巨噬细胞凋亡也明显增加,75 mg/L oxLDL最明显,pcsk9 mRNA和蛋白质的表达也在该浓度最高．提示pcsk9 siRNA能有效抑制pcsk9基因的表达,从而有效抑制由oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡．     

大肠杆菌对体外培养的THP-1细胞凋亡的影响

目的探讨大肠杆菌(E.coli)感染与THP-1细胞凋亡的关系.方法以THP-1细胞作为E.coli感染的体外细胞模型,当细胞与细菌浓度比分别为1:5,1:10,1:20,1:50及1:100时,用荧光染色技术、Annexin V/PI双染流式细胞仪检测分析等方法检测细胞凋亡率.结果细胞与细菌浓度比较低时(1:5)即可引起部分THP-1细胞发生凋亡,THP-1细胞凋亡百分率随E.coli感染剂量的增加而增加.Hoechst33258荧光染色及流式细胞仪二种方法所得结果一致.结论 E.coli以剂量依赖方式诱导THP-1细胞凋亡.     

LDL、oxLDL对THP-1巨噬细胞PCSK9、LDLR表达的影响研究

为研究低密度脂蛋白(LDL)、氧化修饰的低密度脂蛋白(oxLDL)对THP-1源性巨噬细胞中PCSK9、 LDLR表达的影响及两者之间的关系.分别用0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L的LDL和0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L的oxLDL处理THP-1巨噬细胞,油红O染色检测细胞荷脂情况,免疫荧光检测THP-1巨噬细胞上PCSK9蛋白表达及分布情况,RT-PCR、 Western blot检测THP-1巨噬细胞上PCSK9、 LDLR mRNA、蛋白质的表达.结果发现,不同浓度LDL处理THP-1巨噬细胞后,随着LDL浓度的增大,细胞内脂滴数目略有增多.免疫荧光染色发现,PCSK9在THP-1巨噬细胞上的表达随LDL浓度的增加而增多,胞浆内定位于某一特定细胞器中;RT-PCR、 Western blot检测发现,LDL可以呈浓度依赖性下调THP-1巨噬细胞中LDLR的表达和上调PCSK9的表达.不同浓度oxLDL处理THP-1巨噬细胞后,随oxLDL浓度的增大,脂滴颗粒明显增加;oxLDL处理对THP-1巨噬细胞上PCSK9、 LDLR mRNA、蛋白质的表达影响均不明显.研究结果表明:THP-1巨噬细胞上,同时有PCSK9和LDLR的表达,且PCSK9定位于胞浆中某一特定细胞器;oxLDL对THP-1巨噬细胞LDLR和PCSK9表达没有影响;LDL能够降低THP-1巨噬细胞表面LDLR的表达,同时上调PCSK9表达,初步说明在THP-1巨噬细胞中,两者有一定的相关性.     

大肠杆菌感染与人巨噬细胞系U937 细胞凋亡的关系及NF-κB的变化

目的探讨大肠杆菌(E.coli)感染与人巨噬细胞系U937细胞凋亡的关系及核转录因子(nuclear factorkappa B,NF-κB)表达的变化。方法以Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测及Hoechst 33258荧光染色观察为指标,研究E.coli感染对人巨噬细胞系U937细胞凋亡的诱导作用;用Western blot方法检测NF-ΚB的表达。结果Ho-echst 33258荧光染色结果表明当细胞与细菌浓度比较低时(1:10)可引起部分细胞凋亡,Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪结果表明,当细胞与细菌浓度比为1:20,1:50及1:100时,细胞凋亡率与对照组相比明显增高,有显著性差异(P<0.001)。NF-κB的表达随着E.coli浓度的增加而逐渐降低。结论E.coli以剂量依赖的方式诱导U937细胞凋亡,在此过程中NF-κB的表达逐渐降低。     

siRNA分析nm23-H1基因与人慢性髓性白血病的关系

设计并筛选靶向nm23-H1基因的siRNAs序列,探讨nm23-H1基因与人慢性髓性白血病之间的关系。依据siRNA设计原则,设计3条siRNA序列。将不同靶点的siRNA用lipofectamine2000转染人慢性髓性白血病细胞株K562。转染后24h RTPCR检测nm23-H1mRNA水平变化;转染后48h免疫细胞化学法检测nm23-H1蛋白表达。MTT法检测转染后24h、48h和72h有效siRNA对K562细胞生长的影响。3条siRNA中,siNM526能有效地抑制K562细胞nm23-H1基因表达,转染siNM526的K56细胞生长受到抑制。说明下调nm23-H1基因的表达有抑制K562细胞增殖的作用,即降低了K562细胞的恶性程度。nm23-H基因有可能成为白血病治疗潜在的分子靶点。     

KDR靶向RNA干扰对MCF一7细胞凋亡的影响

目的：研究KDR靶向RNA干扰对MCF-7细胞凋亡的影响,探讨其可能的机制。方法：采用阳离子脂质体Lipofecta．mine2000TM作为转染试剂将人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱RNAi,采用Hoechst33258染色和半定量RT—PCR检测Caspase-3、survivin的mRNA表达及细胞凋亡变化;比色法检测Caspase．3的活性;利用免疫组织化学方法检测survivin的表达,并用图像分析仪分析蛋白表达强度。结果：靶向KDR的siRNA转染MCF-7后,Caspase-3的mRNA表达上调,survivin基因mRNA及蛋白表达水平下调（P〈0．05）。结论：KDRsiRNA通过减少乳腺癌细胞survivin的表达,增加Caspase．3表达来促进肿瘤细胞凋亡,发挥其抗肿瘤作用。     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

pcsk9/NARC-1在脂质代谢和神经系统中的作用

人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因（pcsk9）编码神经细胞凋亡调节转化酶-1蛋白（NARC-1），该基因属于蛋白转化酶家族. pcsk9/NARC-1通过调节细胞表面低密度脂蛋白受体，从而在胆固醇代谢中发挥重要作用；其两种不同突变类型，可导致血液中胆固醇水平完全相反的变化，出现低胆固醇血症或高胆固醇血症.最近发现, pcsk9/NARC-1可能还影响神经系统分化，调节神经元凋亡. pcsk9/NARC-1与动脉粥样硬化（As）和阿尔茨海默病（AD）的发生可能存在潜在联系.考虑到载脂蛋白E（ApoE）在As和AD中也都起着重要作用，探讨pcsk9/NARC-1与ApoE之间可能的相关性对阐明两者在胆固醇代谢紊乱和神经系统疾病中的作用可能具有重要意义.     

曲格列酮对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达及胆固醇流出的影响

目的:研究曲格列酮对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达及胆固醇流出的影响。方法:采用液体闪烁计数法测定曲格列酮处理后THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出。用RT-PCR和Western blotting的方法检测曲格列酮处理后THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 mRNA水平和蛋白质水平的变化。结果:经曲格列酮处理后,THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出具有时间依赖性的增加,从0h的1．82%上升到24h的7．61%。在mRNA水平和蛋白质水平ABCA1也均随着曲格列酮作用时间增加而表达上调。结论:曲格列酮能增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达和胆固醇流出。     

肝X受体α在泡沫细胞胆固醇流出中的调控作用

以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察肝X受体α(LXRα)在THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出中的调控作用.结果发现,22(R)-羟基胆固醇剂量依赖性增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出, 而DIDS剂量依赖性减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出.逆转录聚合酶链反应显示, 22(R)-羟基胆固醇可增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞LXRα mRNA的表达, DIDS可抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞LXRα mRNA的表达.结果提示,LXRα在巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出中起着重要的调控作用,这为开发和寻找抗动脉粥样硬化药物提供了新的思路.