MntH与含锰过氧化氢酶共表达基因工程菌的构建与发酵优化

构建Mn2+转运蛋白MntH与来源于Thermus thermophilus HB27的含锰过氧化氢酶的共表达基因工程菌,并进行了发酵培养基及培养环境条件的优化,确定培养基中最佳的碳氮源种类及其浓度分别为:甘油7.0 g/L,酵母粉3.75 g/L和蛋白胨11.25 g/L;当培养基中的Mn2+浓度为1 mmol/L时,最佳的IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L。此外,最佳的培养基初始p H值及培养温度分别为:p H 8.0和37℃,在最优发酵条件下工程菌摇瓶发酵培养24 h,过氧化氢酶活最高可达476 U/m L是未优化前3倍。在5 L发酵罐的验证实验中,过氧化氢酶的酶活进一步提高至1 094 U/m L。     

重组菌BL21-HTa-cgkZ产κ-卡拉胶酶的发酵条件优化

【目的】优化重组菌BL21-HTa-cgkZ产生κ-卡拉胶酶的发酵条件。【方法】通过单因子筛选和响应面分析方法对在IPTG诱导下的κ-卡拉胶酶的产生菌BL21-HTa-cgkZ进行产酶条件优化。【结果】该菌产酶的最佳培养基组成为：乳糖7 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,CaCl2 0.666 g/L。最佳诱导条件为：在工程菌接种1.55 h后添加IPTG,IPTG的浓度为0.89 mmol/L,诱导时间为24 h,诱导温度为23.03 °C。并确定了在培养基中添加乳糖、Triton X-100对κ-卡拉胶酶分布的影响。【结论】实验结果为产κ-卡拉胶酶工程菌的规模化生产奠定基础。     

HCMV pp65截短蛋白原核表达条件优化

为了提高HCMVpp65蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了不同发酵条件对其表达的影响,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导时间以及诱导剂IPTG使用浓度等。结果表明,以LB培养基为发酵液,按5%接种量,37℃培养3h后IPTG诱导5h,重组菌菌体生物量为0.6g/L,目的蛋白表达量达18mg/L。用3.7L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达0.85g/L,最高目的蛋白表达量达到25mg/L。     

FGF20原核表达载体构建及在大肠杆菌中优化表达

[目的]构建人FGF20原核表达载体并在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中优化表达。[方法]从胃癌细胞中经RT-PCR扩增FGF20基因并构建p ET28b-FGF20载体,转化E.coli,IPTG诱导表达。对诱导OD值、IPTG浓度、诱导温度、时间及溶氧量进行优化,同时采用正交试验优化培养基配方,以SDS-PAGE及Western Blot检测蛋白表达,以确定最佳表达条件。[结果]构建了p ET28b-FGF20原核表达载体,实现了FGF20蛋白的表达,确定最佳表达条件为:培养基占锥形瓶容积20%,菌体生长至OD600=0.4,加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h。培养基最佳成分为:蛋白胨11 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖0 g/L。[结论]实现了FGF20在大肠杆菌中的优化表达,为其基因工程药物生产及药用研究奠定了基础。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究

为了提高GABAA受体α1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基,接种量,温度,摇床转速,pH,诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3%接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h。最高目标蛋白表达量达到136mg/L。     

FGF21(L~(59)R)突变体基因工程菌发酵表达条件的优化

本研究对影响FGF21(L~(59)R)突变体基因工程菌发酵条件的因素进行了优化。采用正交试验确定FGF21(L~(59)R)突变体基因工程菌的最佳LB培养基配方,利用SDS-PAGE电泳检测不同发酵条件对FGF21(L~(59)R)突变体蛋白表达情况。LB培养基最佳配比(g/L):蛋白胨11,酵母粉6,氯化钠10,葡萄糖1;在此基础上优化基因工程菌发酵条件,确定LB培养基p H 6.5~7.2,装液量(溶解氧)20%,菌体密度(A_(600))1.0,IPTG浓度0.6 mmol/L,37℃条件下诱导5 h,突变体蛋白的表达量由优化前的12%提高至35%。结果表明,培养基配方、p H、装液量(溶解氧)、菌体密度(A_(600))、IPTG浓度、温度、诱导时间均对FGF21(L~(59)R)突变体基因工程菌表达量有影响。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究*

为了提高GABAA受体a1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3％接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG 32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h,最高目标蛋白表达量达到136mg/L.     

弧菌外膜蛋白ompk工程菌规模化培养表达初探

目的:为Ompk亚单位疫苗生产提供参数。方法:利用振荡和发酵培养,测定不同培养时间的菌液浊度和蛋白诱导表达效果。结果:工程菌30℃摇瓶培养10h,种子罐培养8～10h,较为合适;摇瓶和5L发酵罐诱导表达培养,升温42℃诱导表达,7h效果较佳;经5批次50L、500L发酵罐诱导表达培养,均可得到重组蛋白表达的工程菌体,50L和500L发酵罐最高生物量分别为5.32g/L和6.38g/L,平均可达到3.75 g/L和4.74 g/L;适当延迟升温诱导前的培养时间,可提高工程菌的得率。结论:初步确定了重组蛋白工程菌规模化诱导表达培养方法,利用500L发酵罐培养可得到诱导表达的工程菌体。     

鲨肝刺激物质类似物在大肠杆菌中的高密度发酵

为建立重组鲨肝刺激物类似物(r-sHSA)的高密度发酵方法,本研究在利用单因素实验和均匀设计实验优化摇瓶发酵培养基的组成和浓度以及诱导剂(IPTG)浓度的基础上,利用5L发酵罐进行了放大试验,探讨了补料方式、补料培养基的组成和浓度、诱导剂加入时间和诱导后菌体的收获时间对工程菌生物量和r-sHSA产量的影响。结果表明:在改良LB培养基(0.97%甘油,0.91%酵母粉,0.72%胰蛋白胨,0.782%KH2PO4,0.267%K2HPO4·3H2O,0.062%MgSO4·7H2O,0.5%NaCl,pH7.0)中,当pH控制在7.0、溶氧浓度为25%～30%的前提下,采用指数补料方式加入优化后的补料培养基(620g/L甘油,94.8g/L胰蛋白胨,3.3mL/L微量元素,7.5g/LMgSO4·7H2O)进行培养,在工程菌的OD600达到23时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导6h后收获菌体,菌体的生物量可达(123.27±1.184)g/L,r-sHSA产量为(2.662±0.041)g/L,比优化前提高了13.7倍。     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

荧光假单胞菌天冬氨酸转氨酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用克隆基因测序技术,从荧光假单胞菌GcM5-1A基因组文库中筛选到了天冬氨酸转氨酶的编码基因aspC。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因,插入pET-15b构建重组表达质粒pET-15bAAT,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中高效表达,利用亲和层析法初步分离纯化了重组蛋白。生物活性分析表明,纯化的重组天门冬氨酸转氨酶具有氨基转移活性。     

ASCT2胞外域ECL2原核可溶性表达条件的优化及其纯化

目的构建重组人ASCT2胞外域ECL2融合蛋白的原核表达载体，优化其在大肠埃希菌中可溶性表达的条件，并获得纯化的ECL2蛋白。方法以PCR方法扩增编码ECL2的DNA片段，插入至pET-41b载体中，构建ECL2的原核表达载体，转化至大肠埃希菌，优化可溶性表达条件，GSH—Agarose亲和层析纯化并鉴定，与MCF-7细胞结合活性的测定。结果免疫印迹显示，ECL2融合蛋白既表达于包涵体中，也能以可溶性形式表达。随IPTG浓度的增高，可溶性表达水平提高；培养温度为28℃和33℃时可溶性产物高于37℃；而随诱导时间的延长至12h以上，可溶性表达量下降。可溶性表达优化条件为：温度33℃、IPTG浓度0．4mmol／L、诱导时间4h。经亲和层析获得高纯度ECL2蛋白并具有与MCF-7细胞结合活性。结论优化了ECL2融合蛋白的可溶性表达条件，通过亲和层析一步法可获得高纯度融合蛋白。     

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。     

白鹅催乳素基因的克隆及诱导表达条件的优化

摘要: 运用RT-PCR方法, 从白鹅脑垂体总RNA中扩增得到了催乳素(Prolactin, PRL)基因编码区序列cDNA, 并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列分析表明, PRL cDNA包括终止密码子在内的长度为690 bp，编码230个氨基酸残基的蛋白质, 与皖西白鹅的有所差异, 二者碱基同源性在99.57%, 氨基酸同源性达99.56%。将PRL基因编码区序列cDNA定向克隆到表达载体pET-32a (+)中, 构建表达质粒pET-32a(+)-PRL。该质粒的BL21 (DE3)转化菌在IPTG的诱导下可表达PRL基因融合蛋白, IPTG终浓度1 mmol/L, 37℃, 诱导4 h表达量最高, 表达量约占菌体总蛋白的28.96%。     

抑菌蛋白Reg3A的表达纯化与功能

利用原核表达系统表达人源抑菌蛋白Reg3A,经包涵体的复性和纯化获得有体外抑菌功能的活性抑菌蛋白,并对其体外抑菌功能进行初步研究。构建Reg3A原核表达载体PET-32a-Reg3A转化补充稀缺tRNA基因的表达菌株大肠杆菌BL21-Codonplus,阳性重组子采用诱导培养基诱导5h后,采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白,经包涵体蛋白的纯化和透析复性后通过Ni-NTA亲和层析交换柱,获得纯度达95%的蛋白质。Western blot鉴定显示在15 kD处有特异性条带。使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌圈实验和抑菌活性实验,对获得蛋白的体外抑菌活性进行评估,从而为进一步进行Reg3A蛋白功能的评估及应用奠定基础。     

猪抵抗素(resistin)的原核表达及表达产物的纯化鉴定

用PCR方法扩增到抵抗素基因(Resistin, RSTN)并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-RSTN。将重组质粒转化大肠杆菌BL-21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测结果表明,重组resistin蛋白分子量大小约30kDa。对表达条件如温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化并用SDS-PAGE检测。结果表明,30℃、4h、IPTG浓度为1mmol/L时,可溶性重组resistin的含量最高。表达产物经Western blot检测证实是Resistin蛋白,并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白。     

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

DC-SIGN胞外区基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

旨在构建DC-SIGN胞外区基因原核表达质粒,诱导蛋白表达并制备多克隆抗体。用PCR的方法扩增编码DC-SIGN胞外区的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达DC-SIGN胞外区蛋白,用H is抗体做W estern Blotting鉴定目的蛋白的免疫原性。用纯化的DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,免疫荧光法检测其特异性。结果显示,原核表达载体pET-28 a(+)-DC-SIGN胞外区基因成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,获得相对分子质量约20 kD的DC-SIGN胞外区蛋白,经Westernb lotting鉴定为正确。纯化后的蛋白免疫大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫原性和特异性。本研究得到了纯化的DC-SIGN胞外区蛋白,并制备了具有特异性和高效价的抗体,为研究DC-SIGN生物学功能提供试验基础。     

Cd1-型亚硝酸盐还原酶脱氮工程菌的构建与表达

目的用基因工程技术将铜绿假单胞菌PAO1中nirS基因定向克隆至表达载体pQE-30上，使nirS基因得到高效表达。方法根据GenBank公布的nirS碱基序列和表达载体pQE-30的多克隆位点设计引物，以铜绿假单胞菌PAO1的基因组DNA为模板，应用PCR技术扩增目的片段nirS；之后经过BamH I和HindⅢ双酶切，定向克隆到pQE-30上，化学转化DH5α，构建含有重组质粒的转化子pQE30-nirS-DH5α；经酶切和测序鉴定，扩增产物的碱基序列与GenBank公布的序列完全吻合，再将重组质粒pQE30-nirS转化表达菌株SG13009构建脱氮基因工程菌pQE30-nirS-SG-13009（PNS）。最后用SDS-PAGE（IPTG浓度：0．05mmol／L；诱导温度：25℃；诱导时间：2～3h）和His-tag in-gel Stain鉴定cd1-型亚硝酸盐还原酶的分子量与特异性。结果构建了高效表达cd1-型亚硝酸盐还原酶的脱氮基因工程菌PNS。结论Cd1-型亚硝酸盐还原酶能够在脱氮基因工程菌PNS中得到正确和高效的表达。