家蝇幼虫抗菌相关蛋白/多肽的诱导及抗菌活性分析

对家蝇Musca domestica 3龄幼虫进行针刺、带菌针刺、热激和超声4种处理,并于处理后不同时间分别收集提取家蝇幼虫体内耐热总蛋白,比浊法测定其抗菌活性,经逐步回归分析确定抗菌相关蛋白/多肽。结果表明,4种处理均能诱导家蝇幼虫产生抗菌物质,其中表观分子量为22 kD的蛋白对藤黄微球菌和大肠杆菌均有抗菌作用,50 kD,13 kD,26 kD,7 kD的蛋白抗菌活性具有专一性。还发现一种37 kD的蛋白对抗菌活性有负作用,推测它可能是促进细胞生长的物质。     

家蝇抗菌物质的诱导

针刺损伤诱导的家蝇三龄幼虫免疫血淋巴对动、植物病原菌有广谱的抗菌活性,同时,未经诱导的家蝇幼虫也具有抗菌活性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析表明：外源诱导能增强原有抗菌物质的表达量,并能激活新的蛋白产生。家蝇免疫血淋巴中的抗菌物质具热稳定性和耐冷冻贮藏的特性     

不同提取工艺对家蝇幼虫蛋白粗提液抗菌活性的影响

利用不同条件提取诱导过的家蝇Musca domestica 3龄幼虫的总蛋白,并用平板扩散法测定所得蛋白粗提液的抗菌活性。结果表明,收集幼虫时的处死温度、沸水浴时间及提取液的pH值均对家蝇幼虫粗提液的抗菌活性有明显的影响。     

家蝇幼虫血淋巴中抗真菌肽的诱导方法比较及抗真菌活性

以未诱导组作为空白对照研究比较真菌诱导、超声诱导和热诱导家蝇Musca domestica 幼虫血淋巴初提液的抗真菌肽效果,比较各种诱导方法诱导后的幼虫存活率;用凝胶层析法和高效液相分离纯化热诱导家蝇3龄幼虫抗真菌肽,检测其抗白假丝酵母菌Candida albicans和新生隐球菌Cryptococcus neoformans活性;SDS-PAGE分析抗真菌肽的蛋白分子量范围。结果表明：3种诱导方法诱导后家蝇幼虫均产生具有明显抗真菌作用的抗真菌肽,其初提液抑菌圈大小没有明显差别;真菌诱导组和热诱导组幼虫存活率低于对照组,而超声诱导组与对照组相比则无明显差别。经分离纯化后,抗真菌肽仍具有较好的抗真菌活性;SDS-PAGE分析表明该抗真菌肽有效成分的蛋白分子量在14.4 kD以下。结果提示热诱导家蝇幼虫产生抗真菌肽是一种方便、有效的诱导方式。     

家蝇幼虫抗菌活性物质相关基因表达情况

研究了家蝇幼虫体内抗菌活性物质相关基因诱导后的表达情况。选择30％H2O2诱导家蝇幼虫90min,应用半定量RT—PCR的方法,以组成型表达的β-actin基因作为内参照,对抗菌活性物质基因cecropin,defensin,dipteri．cin,attacin和溶菌酶基因lysozyme在诱导后的表达情况进行了初步探索。Cecropin、defensin和attacin基因在家蝇幼虫体内都是诱导表达型基因,分别在诱导后2h和6h达到活性高峰。而diptericin和lysozyme两个基因表达量一直较高,在诱导后6h表达量达到最大水平,随后开始下降,到诱导后36h时还能检测到基因有较高水平的表达。     

应用iTRAQ标记技术结合2DLC-MS/MS分析家蝇幼虫免疫诱导后血淋巴蛋白质组

目的分析家蝇幼虫免疫诱导前后血淋巴中的免疫防御相关靶标,探索其先天性免疫机制。方法采用同位素标记及相对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)结合2D LC-MS/MS对家蝇幼虫诱导前后的血淋巴蛋白质组进行研究。结果与对照组比较研究后共获得237个不同肽段,鉴定到13个具有定量信息的差异蛋白。免疫刺激后显著上调的蛋白有9个,下调蛋白4个(P0.05),对鉴定到的差异蛋白进行理化性质分析和GO(gene ontology)注释分析,发现这些蛋白分别具有抗菌、抗氧化、催化结合等功能,并参与了免疫、代谢、应激、转运等生物学过程,表明对家蝇幼虫经诱导后血淋巴中多种功能蛋白的表达发生了变化。结论 iTRAQ标记技术结合2D LC-MS/MS可以有效地分离鉴定昆虫血淋巴蛋白质组,为深入研究差异蛋白的功能奠定了基础。     

不同诱导条件下家蝇(Musca domestica)三龄幼虫免疫相关基因的表达研究

旨在研究在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。采用冷刺激、热刺激及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌注射诱导12 h后提取家蝇三龄幼虫总RNA。根据GenBank公布的家蝇磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因、攻击素(Attacin)、天蚕素(Cecropin)、防御素(Defensin)、双翅肽(Diptericin)、溶菌酶(Lysozyme)、热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)及家蝇抗真菌肽(MAF-1)基因序列进行RT-PCR反应,以GAPDH基因为内参照,分析在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。结果显示,不同条件诱导下,家蝇免疫相关基因表达显现较大差异,微生物诱导比物理刺激诱导后家蝇免疫相关基因表达水平高;真菌、阳性菌诱导后家蝇免疫相关基因表达量最高,阴性菌次之;冷刺激诱导最低。微生物及物理刺激均能激活家蝇的免疫系统,在不同条件刺激下,家蝇幼虫机体免疫应激反应不同。     

家蝇幼虫消减文库的构建及差异表达基因的鉴定

为了鉴定家蝇Musca domestica免疫相关基因,应用抑制性消减杂交技术,构建刺激家蝇幼虫差异表达cDNA消减文库。以大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus诱导12 h的家蝇幼虫与未诱导的家蝇幼虫为消减杂交对象,获得了差异表达基因的cDNA片段,将其与T/A载体连接并转化大肠杆菌DH5α,构建了刺激家蝇幼虫cDNA消减文库。PCR检测发现,文库的阳性克隆中插入的cDNA片段大小在200~1 000 bp之间,随机挑选了161个含大小不等差异片段的克隆进行测序和同源性分析,鉴定了36种蛋白的基因片段,包括抗菌肽、酶、核糖体蛋白、其他功能蛋白以及功能不明的蛋白。用半定量RT-PCR分析了其中6种蛋白基因的表达,结果显示：防御素和攻击素基因在细菌刺激后24 h内明显上调表达,而溶菌酶、酚氧化酶原活化因子、糜蛋白酶和蛋白质合成起始因子基因在细菌刺激后0-4 h内表达受抑制,12 h后上调表达。该研究结果为家蝇免疫相关基因的克隆和家蝇免疫防御机制的探讨奠定了良好的基础。     

家蝇Mdsirt1基因在细菌、高温和重金属胁迫下的表达分析

【目的】探究家蝇Musca domestica sirt1基因(Mdsirt1)在各种胁迫条件下的表达模式。【方法】以家蝇2龄幼虫cDNA为模板,PCR扩增Mdsirt1基因序列并进行生物信息学分析;实时定量PCR(qRT-PCR)检测Mdsirt1在家蝇不同发育阶段(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹和成虫)的表达变化,2龄幼虫不同组织(表皮、肠道、脂肪体和血细胞)中的表达分布,以及胁迫条件(细菌刺激、热激及CdCl_2刺激)下的转录水平变化;通过RNAi干扰Mdsirt1基因表达,观察敲低Mdsirt1表达后家蝇幼虫抗病能力变化,并检测机体氧化应激水平。【结果】家蝇Mdsirt1基因编码蛋白含有SIR2结构域,与厩螫蝇Stomoxys calcitrans SIR2氨基酸序列一致性为66%。qRT-PCR结果显示,Mdsirt1基因主要在家蝇蛹期表达,在家蝇2龄幼虫脂肪体中表达量较高。家蝇幼虫Mdsirt1分别在大肠杆菌Escherichia coli刺激3 h,金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus刺激6 h,42℃热激30min以及30 mmol/L CdCl_2刺激48 h时表达量达到最高峰。敲低Mdsirt1表达的家蝇幼虫受到细菌感染(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1∶1混合感染)后存活率较对照组显著降低1.47倍,且敲低Mdsirt1后机体处于氧化应激状态,活性氧自由基水平和丙二醛含量较对照组分别升高1.58和1.59倍。【结论】Mdsirt1参与家蝇幼虫的抗菌免疫应答和抗逆反应。     

家蝇肽聚糖识别蛋白(PGRP-SA)的克隆表达及细菌结合研究

对家蝇PGRP-SA基因进行克隆表达以及研究其重组蛋白与细菌结合能力。从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫cDNA质粒文库中筛选到PGRP-SA基因,以cDNA质粒为模板设计引物,通过PCR扩增,获得PGRP-SA基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化。利用半定量RT-PCR检测PGRP-SA在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达量差异。PGRP-SA重组蛋白进行微生物结合实验。结果表明,PGRP-SA基因ORF全长615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量22.8 k D,等电点9.11,具有保守的PGRP结构域。成功构建了pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,利用Western blot检测证明纯化蛋白与预期大小相符。PGRP-SA在家蝇3龄幼虫血淋巴、脂肪体、前肠、中肠、气管、马氏管都有表达,血淋巴组织中表达量最高,后肠无表达,由此说明PGRP-SA基因的表达具有一定的组织性。PGRP-SA重组蛋白能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合,与白色念珠菌不能结合。成功表达及纯化家蝇PGRP-SA蛋白,证实家蝇PGRP-SA能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合。     

黄粉甲幼虫抗菌物质的诱导及其抗菌活性

采用饥饿法、紫外线照射法和针刺法处理黄粉甲Tenebriomolitor 6龄幼虫后均能诱导其 产生抗菌物质,收集的血淋巴上清液对真菌有抑制作用,对细菌无抑制作用;经热处理后的血 淋巴上清液则对细菌有抑制作用,而对真菌无抑制作用。SDS-PAGE检测结果发现,与未诱导的 对照相比经诱导的黄粉甲幼虫血淋巴中,原有的一类大分子蛋白质如分子量分别为97kD、44 kD和37 kD左右的蛋白质缺失;而ESI-MS分析结果显示诱导后比诱导前黄粉甲幼虫血淋巴中有 小分子物质产生,推测可能是此类缺失蛋白质分解为小分子量的抗菌肽,从而表现出抗菌活性 。     

家蝇幼虫体内一种抗菌蛋白的分离纯化

30%H2O2诱导家蝇幼虫90min,继续饲喂24h后利用硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25 和Sephadex G-75两步凝胶过滤、CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换的纯化方法,得到一种电泳纯的抗菌蛋白,经过VDS凝胶扫描得到其分子量为28kDa,命名为AP28。抑菌活性分析表明,AP28对实验中涉及的大多数革兰氏阳性菌和阴性菌都有明显的抑制作用。     

家蝇抗菌肽的抑菌动力学研究及其机理初探

利用鼠伤寒沙门氏菌针刺诱导家蝇幼虫表达抗菌肽,对抗菌肽的抑菌动力学进行研究,并通过抗菌肽样品对不同细菌动力学特性的研究出发对抗菌肽抑菌作用机制进行探讨。研究发现抗菌肽样品的活性与作用时间有关,24h内出现一到两个活性峰,同一抗菌肽样品对不同细菌的抑菌动力学有差异,抗菌肽的抑菌动力学机制应该与它的的抑菌作用机制有关。通过电镜观测、细胞磷代谢、紫外吸收物测定以及抗菌肽与细菌DNA相互作用结果可知,微生物诱导家蝇表达的抗菌肽样品不仅能够造成细菌细胞的快速坍塌破裂而且能够破坏细胞核心,与DNA结合作用。抗菌肽抑菌动力学的解释：微生物诱导产物中含有两类抗菌肽,一类抗菌肽能造成细胞膜的快速坍塌破裂形成第一个活性峰;另一类抗菌肽可进入细胞,破坏细胞核心,造成紫外吸收物大量外泄形成第二个活性峰。     

家蝇幼虫壳聚糖的抑菌活性及影响因子

为研究昆虫壳聚糖的抑菌活性及影响因子, 由家蝇Musca domestica幼虫制备了10个不同分子量的壳聚糖,在不同条件下分别对6种细菌作抑菌实验, 并通过测定细菌细胞膜和细胞壁的透性初步探讨了壳聚糖的抑菌机理。结果表明,分子量在21～251 kD的壳聚糖有很强的抑菌活性,抑菌活性呈现随pH的降低而增加的趋势,pH 5.5时最低抑菌浓度在0.03％～0.06%之间,Ca²⁺和Mg²⁺能够显著降低壳聚糖的抑菌作用。通过对实验结果的方差分析表明,壳聚糖的不同分子量、pH值和金属离子等外界因素都是壳聚糖抑菌活性的极显著影响因素,而菌株本身也是极显著影响因素之一。壳聚糖能够增加细胞膜通透性,造成细胞内容物的外泄。     

家蝇幼虫分泌物抗菌肽的生化特性初步研究

研究了不同温度、蛋白酶及反复冻溶对家蝇 Musca domestica 幼虫活体浸泡法获得的分泌物抗菌肽抗菌活性的影响;并检测其凝血效应;试管稀释法测定其最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）;SDS-PAGE分析其分子量范围。结果表明,该抗菌肽具有较强的热稳定性、酶稳定性及较强抗菌活性的特性,无凝血作用。对大肠埃希菌的最低抑菌浓度为37 μg/mL、最低杀菌浓度为75 μg/mL;分子量约10 kD。     

Lipid Requirement for the Lipase Production by Geotrichum candidum Link

The injection of live or heat-killed bacteria into larvae of the silkworm, Bombyx mori, induced antibacterial activity in the hemolymph. A wide variety of gram-negative and gram-positive bacteria were effective as inducing agents, but saline alone, yeast cells and fungal spores were not effective. The antibacterial activities were separated into six bands on native polyacrylamide gel electrophoresis, which were sensitive to trypsin. Some of these antibacterial proteins were partially purified by CM-cellulose column chromatography. The proteins were heat-stable and showed no lysozyme activity. The proteins repressed the growth of various gram-positive and gram-negative bacteria.     

Novel antibacterial peptides induced by probiotics in Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) larvae

There is a need to discover new therapeutic substances due to the emergence of deadly infectious diseases and various antibiotic resistance. We focused on the larvae that are utilized as a medical insect for the treatment of skin damage in Europe and America. This study was to investigate the pharmacological activities of novel antibacterial peptides isolated from Hermetia illucens larvae against the Klebsiella pneumoniae and Shigella dysenteriae. The larvae were immunized by probiotics (Lactobacillus casei) for 24 h. The hemolymph from the immunized larvae was fractionated through reverse‐phase chromatography. Peptides were purified using HPLC and the coomassie blue staining, and identified using Nano‐LC‐ESI‐MS/MS system. Antibacterial activities of the peptides were evaluated by turbidometric assay, liquid broth dilution assay, resazurin assay, and agar disk diffusion method. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of the peptides were measured as 150 μg/mL through the turbidometric, liquid broth dilution, and resazurin assays. The peptides effectively inhibited their growth/proliferation as well as the survival rate of the tested bacteria. Furthermore, the immunized larvae exhibited overexpression of the peptides compared to non‐immunized larvae. These results demonstrate that the peptides induced by H. illucens exert strong antibacterial activity against Gram‐negative bacteria. The results suggest that the activation of the humoral immunity induced by immunization functioned to enhance the production of antibacterial peptides from the insect and their antibacterial properties. This study indicates the potential of the peptides produced from larvae as antibacterial peptide substance for the development of novel antibacterial drugs.