球孢白僵菌羧基转运蛋白基因BbJEN1及其上游序列的克隆与分析

在分析一株球孢白僵菌TDNA插入突变体T12的Tagging序列的基础上,根据与其具有高度同源性的一条金龟子绿僵菌EST序列（编号为AJ273226）设计简并引物,用YADE法从球孢白僵菌中扩增出该EST的同源序列及其延伸序列。序列分析表明,该片段与粗糙脉孢霉的羧基转运蛋白JEN1具有高度同源性,由此确定该序列为球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1基因的部分序列。然后利用YADE法延伸扩增该序列的上、下游序列,获得球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的全长DNA序列,命名为GBbJEN1。利用3′RACE扩增出球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的cDNA序列,命名为BbJEN1。BbJEN1全长1656bp,编码514个氨基酸的蛋白。推测蛋白分子量为55975.37Da,等电点9.32。氨基酸序列与金龟子绿僵菌、粗糙脉孢霉和酿酒酵母羧基转运蛋白JEN1的同源性分别为77%、66%和30%。序列分析表明,GBbJEN1含有2个内含子。Southern杂交表明,GBbJEN1基因在球孢白僵菌基因组中为单拷贝。利用RTPCR法对BbJEN1的表达特性进行了分析,结果发现BbJEN1基因的转录受蟑螂壳、蝉蜕等昆虫体壁的诱导,受葡萄糖的抑制。进一步利用YADE法获得了长为977bp的GBbJEN1上游序列,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列和压力反应元件。     

金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株———金龟子绿僵菌CQMa102NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTLcDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102NTL基因cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102NTL的完整基因。为了解该基因的上游调控信息,采用PanhandlePolymeraseChainReactionAmplification方法扩增其上游序列。序列分析表明,CQMa102NTL全长DNA3484bp,cDNA全长2385bp,编码737个氨基酸的蛋白,推测蛋白分子量为83.1kD;含有3个内含子,包含一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙附着位点(DTDGNMQITIED);上游序列含有一个压力反应元件(CCCCT);与金龟子绿僵菌广谱性菌株ME1NTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有93%和99%同源性,由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列。Southern杂交表明,NTL基因在CQMa102基因组中为单拷贝。Northern杂交表明,NTL基因转录出约2.5kb的mRNA单带,在液体培养条件下,对数生长前期表达水平最高,对数生长后期降到最低,进入稳定生长期后表达水平又有所提高。金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因DNA全长和cDNA全长登录GenBank,登录号分别为:AY557613,AY557612。     

绿僵菌第五类Ser/Thr蛋白磷酸酶基因的克隆及表达特征分析

【目的】克隆绿僵菌第五类Ser/Thr蛋白磷酸酶(PP5)基因,了解该基因及其编码产物的结构特征和两种产孢模式(微循环产孢和正常产孢)中的表达特征。【方法】通过绿僵菌中PP5基因EST序列与全基因组数据库比对,获得PP5基因DNA序列;通过同源蛋白比对预测PP5基因的DNA结构并设计引物,PCR扩增获取PP5全长cDNA序列;通过在线分析工具及生物软件进行蛋白结构分析。采用实时荧光定量PCR检测PP5基因在两种产孢模式中的表达特征。【结果】PP5基因长2100 bp,含7个外显子和6个内含子;cDNA开放阅读框长为1428 bp(GenBank登录号HQ317137),编码475个氨基酸;一级、二级及三级结构分析均显示较保守的蛋白磷酸酶结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,PP5基因在绿僵菌微循环产孢的不同阶段表达水平具有显著性差异,特别是在孢子接种16、24、32 h高表达,而在正常产孢模式下表达量非常少。【结论】克隆了绿僵菌的PP5基因,详细了解了该基因及其编码产物的结构特征,发现了该基因在微循环产孢孢子形成后期高表达的重要特征,为进一步研究该基因在微循环产孢中的功能奠定了基础。     

绿僵菌微循环产孢基因Pyk的克隆及RNA干扰分析

微循环产孢是真菌遭遇逆境时发生的一种产孢机制,具有繁殖快速及抗逆性强等诸多优点。研究绿僵菌的微循环产孢机制并加以利用,对增强该菌在生物防治中的应用效果具有重要的意义。采用绿僵菌基因组数据库与NCBI数据库中同源蛋白比对获得Pyk基因DNA序列;分析Pyk基因结构并设计引物,通过RT-PCR扩增克隆Pyk全长cDNA序列。序列分析显示该基因cDNA全长1 934 bp,开放阅读框长为1 752 bp(GenBank登录号:HQ153828),编码产物为583个氨基酸的丙酮酸激酶,该酶与子囊菌门中其他真菌具有较高的相似性(57%-77%)。构建Pyk基因的RNAi载体,基因枪转化野生型绿僵菌获得3个突变菌株,RT-PCR证实3个干扰突变菌株中Pyk基因的干扰效率分别为:51%、56%、33%。对突变菌株的微循环产孢模式做了进一步分析,结果显示:与野生菌株相比,突变菌株产生更多的孢子形态类型,菌落周边的白色菌丝也相对较少。     

安徽省土壤绿僵菌分离株的分子鉴定

目的进一步验证ITS序列的系统发育分析可为绿僵菌属种的鉴定提供重要的参考依据。方法对分离自安徽土壤的13株绿僵菌菌株的内转录间隔区（ITS）片段进行PCR扩增和序列测定,采用Blast方法将测序结果在GenBank中进行同源搜索,依据邻接法构建获得与其相关菌株的ITS序列系统发育树。结果供试菌株分别位于系统发育树的3个分支上,分支I包括8个菌株和金龟子绿僵菌小孢变种,1个菌株和金龟子绿僵菌鳞鳃金龟变种形成分支III,另外4个菌株和黄绿绿僵菌棉蚜变种聚为分支X。结论结合同源比较的数据,将这8个、4个和1个绿僵菌菌株分别鉴定为金龟子绿僵菌小孢变种、黄绿绿僵菌棉蚜变种和金龟子绿僵菌鳞鳃金龟变种。     

球孢白僵菌降解昆虫体壁蛋白酶基因 CDEP-1的克隆与序列分析

构建了球孢白僵菌不同诱导时间的混合cDNA文库。根据丝氨酸类蛋白酶的保守区域设计引物,以构建cDNA文库同样的mRNA为模板,采用RT-PCR法得到长度为594bp的片段BbP。序列测定表明BbP是球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶Prl的一部分,以BbP为探针,从上述cDNA文库筛选得到长度为1557bp的克隆CDEP-1。CDEP-1含有一个1134bp的开放阅读框（ORF）,编码377个氨基酸,分子量为38616、PI=8.302的蛋白酶前体。CEDP-1的核苷酸序列与蛋白酶K、金龟子绿僵菌Prl、球孢白僵菌Prl的同源性分别为：57.9%、54.7%、83.3%。根据cDNA序列扩增到CDEP-1的基因组序列,分析表明其中含有3个内含子。Southern杂交表明CDEP-1在球孢白僵菌是单拷贝。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶基因的克隆及高效表达

几丁质酶是昆虫病原真菌金龟子绿僵菌致病力的主要因子之一。本实验用RT-PCR方法,从本实验室分离筛选到的高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae HN1中,扩增得到几丁质酶基因全长,此基因全长为1275bp,登录号为DQ011865,经Blastn分析此基因序列与M. anisopliae E6的chi1基因（AF02749）同源率为96% 。以pET-22b(+)为基础载体,构建pET-chi重组表达载体,在大肠杆菌（Escherichia. coli ）BL 21中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了42kDa大小的重组目的蛋白,目的蛋白占表达总蛋白含量的63.3%。菌体经冷冻与超声波破碎后,按DNS法可测得几丁质酶的活性。     

用YADE法克隆球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的启动子及启动子序列分析

扩增与已知序列相连的未知序列是一项常用的分子生物学技术。与其它方法相比,目前在棉花上应用的YADE法具有效率高,成本低和假阳性低等特点。因此,作者尝试将该法引入到昆虫病原真菌的分子生物学研究,并取得了成功,建立了适合于球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的YADE的技术体系。类枯草杆菌蛋白酶在昆虫病原真菌穿透寄主体壁时起重要作用,作者在已克隆的球孢白僵菌类蛋白酶基因CDEP-1的基础上,利用YADE法,克隆类球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的启动子CDEPP。序列分析发现:CDEPP中没有明显的TATA和CAAT框,含有8个可能的碳调控因子的结合位点5'>(g/c)YggRg<3'和2个氮调控因子的结合位点——相隔很近的GATA。这与CDEP-1的表达受碳/氮抑制的结果一致。本文的结果将会为研究CDEP-1的表达规律奠定基础。     

Gene structure and expression of the gene from Beauveria bassiana encoding bassiasin I, an insect cuticle-degrading serine protease

Genomic and cDNA encoding Beauveria bassiana bassiasin I, a potential cuticle-degrading serine protease, were isolated and analysed. Bassiasin I gene is comprised of 1137 bp (379 aa) and 3 introns which are 69, 62 and 68 bp long. The comparison of a deduced amino acid sequence with Metarhizium anisopliae Pr1, B. bassiana Pr1, and proteinase K showed high homology. When the cDNA including the intact signal peptide was expressed in E. coli, a clear proteolytic-degraded zone on LB-skimmed milk plates was observed.     

Metarhizium anisopliae var. Anisopliae Pr1A基因的克隆表达及抗血清研究

采用RT-PCR方法从本实验室分离筛选到的金龟子绿僵小孢变种Metarhizium anisopliae vat．anisopliae中,扩增得到PrlA基因全长,此基因全长为1242bp,经Blastn分析此基因序列与M．anopliae的PrlA基因(M73795)同源率为98%。以pET- 22b( )为基础载体,构建pET-PrlA重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia．coli)BL 21(DE3)中进行表达。经SDS—PAGE分析,获得了约42kDa大小的重组目的蛋白,目的蛋白占表达总蛋白含量的63．2%。将表达的PrlA蛋白切胶回收后制备成抗原,免疫家兔4次后,采血收集抗血清,用ELISA测定效价为1/10000。结果表明,获得的抗体可用于更进一步的研究,将有利于我们进一步了解M．anisopliaeis的侵染机理,弄清楚各Pr蛋白酶的作用方式和对寄主的选择优势,提高生防控制的有效性。     

粉拟青霉类枯草杆菌蛋白酶基因的cDNA克隆及其序列和蛋白质分析

粉拟青霉是一种常见的昆虫病原真菌,被广泛用于生物防治。根据GenBank中已登录的淡紫拟青霉,球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因序列的同源性比较,以它们高度保守的核苷酸序列设计一对引物,采用RT-PCR和3’/5’-RACE相结合的方法,首次从粉拟青霉中克隆出完整的类枯草杆菌蛋白酶cDNA基因。其全序列为2060bp,该序列5’-端和3’-端的非编码序列长度分别为209bp和252bp,开放阅读框为1599bp,编码532个氨基酸,信号肽长度为16个氨基酸。成熟蛋白的氨基酸序列和金龟子绿僵菌小孢变种(CAB63913),玉米赤霉菌(EAA68914),金龟子绿僵菌蚱蜢变种(CAC95047)及柄孢壳(AAC03564)的同源性分别为69%、71%、68%和68%。成熟蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶活性位点,同时有5个半胱氨酸,3个潜在的N-糖基化位点和2个可能的O-糖基化位点。该基因在的密码子第三位碱基的使用上,显示出明显的对C的偏爱。     

Isolation, Characterization, and Transcriptional Analysis of the Chitinase chi2 Gene (DQ011663) from the Biocontrol Fungus Metarhizium anisopliae var. anisopliae

Metarhizium anisopliae infects arthropods via a combination of specialized structures and cuticle degradation. Hydrolytic enzymes are accepted as key factors for the host penetration step and include chitinases. The characterization of the chi2 chitinase gene from M. anisopliae var. anisopliae is reported. The chi2 gene is interrupted by two short introns and is 1,542-bp long, coding a predicted protein of 419 amino acids with a stretch of 19 amino acid residues displaying characteristics of signal peptide. The predicted chitinase molecular mass is 44 kDa with a mature protein of 42 kDa and a theoretical pI of 4.8. The comparison of the CHI2 predicted protein to fungal orthologues revealed similarity to the glycohydrolase family 18 and a phylogenetic analysis was conducted. The chi2 gene is up-regulated by chitin as a carbon source and in conditions of fungus autolysis, and is down-regulated by glucose. This regulation is consistent with the presence of putative CreA/Crel/Crr1 carbon catabolic repressor binding domains on the regulatory sequence.     

球孢白僵菌FUS3/KSS1类MAPK同源基因(BbMPK1)的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌FUS3/KSS1类MAPK的保守序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK基因的部分片段,进而利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK基因的全长序列,命名为BbMPK1。用3′RACE扩增出BbMPK1的全长cDNA序列,该序列含有一个1071bp的ORF,编码356个氨基酸的多肽,推测分子量为41.2kDa,等电点为6.61。BbMPK1含有11个MAPK共有的蛋白激酶区域和1个MAPK激酶作用的磷酸化位点区域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的TMKA、PMK1、CMK1、FMK1和BMP1等MAPK高度同源。系统聚类结果表明,BbMPK1属于酵母FUS3/KSS1类MAPK。Southern杂交表明,BbMPK1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR分析表明BbMPK1在分生孢子休眠阶段、萌发阶段和菌丝生长时期均表达。研究结果为阐明酵母FUS3/KSS1类MAPK同源基因在球孢白僵菌中的作用奠定了基础。