十字花科植物SAMDC基因同源序列的克隆与进化分析

腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)是参与植物多胺合成的一个关键酶。根据GenBank中已报道的SAMDC基因编码序列保守区域设计特异引物, 运用PCR技术分别从十字花科6属14个物种中新克隆分离了SAMDC基因的同源序列。比较分析结果表明: 这些同源序列的相似性达87%以上, 所推导的氨基酸序列相似性达90%以上, 且两者种间差异分别为0.2%~10.1%和0.3%~6.6%, 属间差异除“圆白”萝卜外分别是4.9%~13.6%和3.1%~10.3%; SAMDC基因的核苷酸及其可能编码的氨基酸序列差异属间较种间大, 可用于属间的分类等级研究; 且氨基酸序列间的差异比核苷酸序列间的差异小的多, 因而根据核苷酸序列构建了NJ与ME分子系统树。进化树直观地表明在亲缘进化关系上芸薹属与萝卜属较近, 其他依次为山芥属、蔊菜属、拟南芥属, 与荠菜属最远。研究结果有助于从分子水平阐明十字花科植物间的亲缘进化关系, 可为其种质资源利用提供理论依据。     

荠菜LEAFY同源基因的克隆与进化分析

LEAFY同源基因是高等植物花的分生组织分化的重要调节基因。根据已发表的LEAFY同源基因序列保守区设计引物,以荠菜(Capsellabursa-pastoris(L.)Medic.)基因组DNA序列为模板,克隆了一条长2866bp的LEAFY同源基因。序列分析表明,该基因含有3个外显子和2个内含子,外显子编码424个氨基酸组成的多肽。其单个外显子核苷酸序列与拟南芥(Arabidopsisthaliana)LEAFY基因同源性在90%以上,氨基酸序列同源性为86%,而与琴叶拟南芥(Ara-bidopsislyrata)的氨基酸序列同源性高达90%。不同植物物种的LEAFY同源氨基酸序列在C端高度保守,而N端则有较大程度的变异。3个外显子进化速率不同可能是由于所受选择压力不同所致。存在于荠菜CapLFY基因346位上的精氨酸突变可能是造成荠菜两种生态型花期不同的原因。     

甜瓜抗枯萎病基因同源序列克隆与序列分析

目的:克隆甜瓜抗枯萎病基因同源序列并对其序列分析。方法:根据已发表的甜瓜抗枯萎病基因Fom-2设计引物,从高抗枯萎病甜瓜品种‘日本安农二号’基因组中扩增Fom-2同源序列R-Fom-2。结果:该基因长3307bp,包含一个完整的开放阅读框,编码1073个氨基酸,推测蛋白质分子量123.57kDa,等电点7.06。属于nonTIR-NBS-LRR类抗病基因,在LRR区存在一个可能的CC结构域。但在nonTIR类抗病蛋白中,CC结构域一般位于kin-1a前。氨基酸同源性分析显示,R-Fom-2同Fom-2全长序列具有96%的同源性,对不同甜瓜品种Fom-2的LRR区分析比较,同源性在91%以上。且LRR区的差异主要集中在β-strand/β-turn区域。结论:序列分析揭示Fom-2家族是一个活跃的基因,LRR区可能对Fom-2家族的功能起着重要作用,为进一步研究R-Fom-2基因的结构与生物学功能奠定了基础。     

扬子鳄的CaSox4基因的分子克隆和进化分析

The completely identical HMG-box motif of CaSox4 gene from both male and female genomic DNA of the Chinese alligator (alligator sinensis) was cloned and sequenced by degenerate primer PCR.Compared with the human and mouse SRY,CaSox4 revealed 51% and 57% nucleotide homology respectively and 49% and 55% amino acid identity respectively,CaSox4 belongs to subgroup C of the Sox gene family.The GC content is 86% in the HMG-box region of the CaSox4 gene,Blast analysis showed that the CaSox4 gene shares 100^ amino acid identity with human Sox4.bird SoxLF4,turtle Sra4 and lizard CvSox4 genes.Casox4 may be orthologous with the human SOx4 gene.This indicates that CaSox4 gene shows the remarkable evolutionary conservation during the evolution of Alligator Sinensis,The extensive sequence conservation of the Sox4 gene between reptiles,mammals and birds suggests major functional constraints[Acta Zoologica Sinica 49(3):404-407,2003].     

西兰花CYP83A1基因的克隆及序列分析

为深入研究西兰花4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷的合成代谢途径,对关键合成酶基因CYP83A1进行了克隆与生物信息学分析。根据前期西兰花转录组测序工作中获得的序列数据,同时参照Gen Bank数据库中拟南芥、小白菜和油菜等7种植物的CYP83A1基因CDS序列与西兰花进行比对,确定西兰花CYP83A1基因(Bo CYP83A1)的CDS序列。采用RT-PCR技术对其进行了克隆,获得Bo CYP83A1基因的CDS区序列,其全长为1 509 bp,编码502个氨基酸。预测该蛋白质的分子量为57.47 k D,理论等电点为7.1,包含2个跨膜结构域,且整个序列中不含信号肽,具有一个典型的P450结构域。氨基酸同源性分析表明,西兰花与油菜、大白菜的CYP83A1的相似性较高,均为98%。首次获得Bo CYP83A1的CDS序列,其登录号为KM111290。     

家蚕P450基因CYP18A1的克隆、序列分析及转录活性

蜕皮激素对昆虫生长、发育和繁殖有重要调控作用,尤其对蜕皮和变态过程。利用GenBank上登录的蜕皮激素C₂₆羟基化酶候选基因CYP18A1的氨基酸序列对家蚕Bombyx mori全基因组数据库进行BLASTP比对,发现了家蚕直向同源基因(ortholog),其完全编码序列经RT-PCR检测和克隆、测序验证后,再以此为信息探针检索家蚕表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据库进行拼接延伸,获得了一条包括5′非翻译区在内的长度为1 737 bp的cDNA序列,验证结果也表明与电子克隆序列完全一致(GenBank登录号为EF421988,P450命名委员会将其命名为CYP18A1)。该基因的开放阅读框为1 623 bp,编码541个氨基酸,含有包括P450s特征结构域在内的所有昆虫P450基因的5个保守结构域,其推定的分子量为61.67 kD,等电点为 8.54。将该基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有6个外显子,5个内含子,外显子／内含子边界符合经典的GT-AG规则。同源性分析也发现家蚕CYP18A1与其他昆虫的直向同源基因具有较高相似性。用RT-PCR方法对家蚕主要发育变态时期与组织进行检测,显示出该基因的转录表达不仅具有时空特异性,而且在表达时期上与已报道的蚕体内蜕皮激素含量变化有紧密的一致性。该研究进一步证实了CYP18A1基因与昆虫体内蜕皮激素代谢平衡相关联。     

芒果NBS类抗病基因同源序列克隆与分析

根据已知物种NBS抗病类基因（RGAs）保守序列设计引物,从芒果品种“金煌”基因组DNA中分离得到了10条同源序列（pp-1~10,GenBnak登录号为HM446507~16）。DNA序列分析表明,这些RGAs在200~300bp区间存在较大变异,Pi值都在0.4以上。同源性分析表明这些序列的同源性差异范围从11.0%~98.4%,离散值范围为1.6~100.7, 10条RGAs可以分为两大类。蛋白序列分析表明,pp-1~10都具有开放读码框,编码的蛋白含有典型的NBS抗病类基因所拥有的P-loop和Kinase-2a结构域,通过同源进化分析可将其分为TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR两类,与已知物种同源性分别为22%~60%。     

大头蛙Sox基因的克隆与序列分析

参考人SRY基因HMC—box的保守区序列,设计一对特异引物,采用PCR技术扩增了大头蛙的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆与测序。结果在雌雄个体中均扩增出217bp的基因片段,与人对照相同。序列分析表明,大头蛙雌雄个体之间Sox序列没有差异,与人SOX基因的同源性达到88％,与其它各类动物的Sox基因也都有非常高的相似性。结果支持Sox基因在进化上十分保守的结论。     

鸡Tmem9B同源基因的克隆与序列分析

溶酶体跨膜蛋白9B (TMEM9B,c11orf15)是最近被发现的炎症信号通路中的关键因子,在NF-κB和MAPK信号途径起重要调控作用.本实验采用克隆技术成功获得了海兰褐鸡Tmem9B基因的全长编码序列,并利用生物信息学方法对Tmem9B进行序列分析和测序.结果表明,鸡Tmem9B同源基因编码序列全长570bp,进化高度保守,编码189个氨基酸的蛋白,序列上存在信号肽、Tmemb_9和跨膜序列等几种结构域,并含N端豆蔻酰化位点、N端糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点等3种修饰位点.同时,在鸡Tmem9B基因的开放阅读框内预测到5个microRNA靶位点,Tmem9B在鸡的骨骼肌、肾、脑等多种组织中广泛表达,推测鸡Tmem9B基因可能具有多种功能.本研究将为深入研究鸡Tmem9B基因的功能奠定基础.     

大肠杆菌ubiC基因的克隆及序列分析

研究以克隆得到正确序列的大肠杆菌ubiC基因目的,实验通过PCR方法从大肠杆菌基因组中扩增得到了ubiC基因,扩增产物克隆到pUC118载体,转化大肠杆菌JM109,DNA序列分析结果表明克隆得到的大肠杆菌ubiC基因碱基序列正确。     

十字花科多肽激素类基因RALF的同源基因克隆及进化分析

多肽激素类基因是对植物生长发育起重要作用的一类基因,RALF是其中的重要一员,而十字花科在中国蔬菜作物中是重要的一大类群。为了摸清十字花科多种蔬菜作物的RALF同源基因信息,该文根据前期研究从油菜中扩增到的多肽激素类基因RALFbn的序列设计引物,从提取的十字花科芸薹属、萝卜属、蔊菜属、山芥属的7份重要蔬菜作物的基因组DNA中分别克隆到了RALF的同源序列。结果表明:7种蔬菜作物的RALF同源基因编码区均在300 bp左右,且无内含子,编码的蛋白质由79个氨基酸组成,说明RALF在十字花科4个属内的保守性较强;对RALF同源基因在十字花科4个属中的表达分析表明,该类基因在根、茎、叶、花序轴等营养器官中不表达或弱表达,但主要在生殖器官中表达,其中在总花蕾和开放花中的表达量普遍高于嫩角果中的表达量,表明该类基因在十字花科中的生理活跃期是花发育时期。同时,构建了十字花科4个属中RALF同源基因的系统树,芸薹属的油菜、甘蓝和芥蓝形成一个分支,而茎瘤芥和分蘖芥形成另外一个分支,且与萝卜属、山芥属、蔊菜属的材料聚在一支,该基因的进化途径在一定程度上也反映出这几种作物的遗传背景关系。该研究结果丰富了RALF家族信息,增添了十字花科植物的分子进化数据。     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

Chlorella sorokiniana rbcL基因的克隆与序列分析及其与18S rRNA基因在分类学上的比较

Rubisco大亚基基因(rbcL)广泛用于系统学分析中,在本文中以Chlorella sorokiniana CS-01叶绿体基因组DNA为模板,PCR扩增rbcL全长编码区序列,序列分析表明:该片段全长1428 bp,其中包括1425 bp的编码区序列,编码475个氨基酸,经BLAST比对发现同源性最高的为Chlorella sp.IFRPD 1018,同源性达到99.2%。同时构建系统发育树,结果显示Chlorellasorokiniana CS-01与Chlorella sp.IFRPD 1018在同一分支中。18S rDNA序列分析表明:该片段全长1740 bp,经BLAST比对发现同源性最高的为Chlorella sorokiniana,同源性达到99.7%,构建系统发育树显示Chlorella sorokiniana CS-01与两株Chlorellasorokiniana在同一分支中,支持率达到100%。但是18S rDNA序列构建的系统发育树鉴定的主要分支很少,即使鉴定出分支,该分支的支持率也比较弱,而rbcL基因序列构建的系统发育树则分支清晰且支持率较高。可见18S rDNA序列比rbcL...     

杨树细胞色素P450类固醇单加氧酶(CYP90)基因的克隆与分析

拟南芥的CPD基因编码一种与植物油菜素内酯(brassinosteroids,BRs)生物合成有关的细胞色素P450类固醇单加氧酶(CYP90 )。为探讨油菜素内酯这类新型植物激素在多年生木本植物中生物合成及作用的分子机理,以拟南芥CPD基因的一个cDNA片段为探针,从一种杂交杨 (Populustremula×tremudelois)的cDNA文库中分离出一个长 1 442bp的cDNA片段,然后再以这个cDNA的 5′区为探针,从这种杂交杨的基因组文库中分离出一个长 1 900bp的基因组DNA(gDNA)片段。测序结果表明,这段cDNA的 5′区与这段gDNA的 3′区重合; 由这段cDNA和gDNA组成的读框编码一个由 476个氨基酸组成的分子量为 63kD的蛋白质。该蛋白与拟南芥CYP90的同源性为 78 32%,比后者仅长 4个氨基酸,在所有已知的功能结构域,其中包括与BR生物合成密切相关的类固醇结合位点,也具有较高的同源性,表明CPD基因在一年生的草本和多年生的木本植物之间具有很高的保守性。系统树分析还表明,CYP90蛋白与番茄和玉米的矮化基因产物、鱼的all trans retinoicacid4 hydroxy lase及微澡青菌(Synechocystissp. )的细胞色素P450在进化上有较密切的联系。     

苦荞黄烷酮3-羟化酶基因F3H的克隆及序列分析

为提高黄酮代谢途径中的关键酶活性,增加苦荞黄酮类化合物的合成量,根据已知植物的F3H基因同源序列,采用RT-PCR和RACE结合的方法,克隆了苦荞黄酮代谢途径中关键酶基因F3H,命名为FtF3H(GenBank登录号:FJ456858)。序列分析结果表明,FtF3H基因长1369bp,编码367个氨基酸,该氨基酸序列及其cDNA序列与葡萄、牵牛F3H等的同源性约80%。二级结构预测表明,随机卷曲是FtF3H蛋白最大量的结构元件,而α-螺旋和β-片层则散布于整个蛋白质中;三维结构建模预测FtF3H蛋白具有铁离子结合位点及2-O-酮戊二酸结合位点等F3H蛋白典型结构。     

番茄SlMYB86基因的原核表达及缺氮胁迫下的表达分析北大核心CSCD

MYB转录因子参与植物细胞形态与模式建成、次级代谢的调控以及生物和非生物胁迫应答等反应。该研究采用RT-PCR方法扩增了番茄SlMYB86基因,并进行了聚类分析和保守域序列分析,构建原核表达载体和诱导纯化蛋白,利用qRT-PCR和Western blot检测SlMYB86在缺氮复氮下的表达水平,为深入探究番茄MYB86转录因子在缺氮胁迫下的功能奠定基础。结果表明:(1)番茄SlMYB86与番茄SlMYB26在进化树上属于同一分支,亲缘关系较近,且SlMYB86含有2个Myb_DNA-binding保守结构域,属于R2R3-MYB型转录因子。(2)qRT-PCR分析发现,SlMYB86基因在番茄根和叶中均有表达,缺氮胁迫下SlMYB86表达较对照显著增加。(3)成功构建pET-28a-SlMYB86原核表达载体并转化E.coli BL21(DE3),SDS-PAGE和Western blot结果表明,SlMYB86蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L的IPTG、37℃诱导8 h;目的蛋白相对分子量大约为41 kD,与预期大小一致,并获得较高纯度的SlMYB86原核蛋白。(4)将纯化的SlMYB86蛋白免疫小白鼠获得抗体,利用该抗体进行Western blot分析发现,番茄中SlMYB86蛋白在缺氮胁迫后表达上调,表明番茄SlMYB86基因参与了缺氮胁迫的应答。     

草莓APETALA2同源基因的克隆及表达分析

利用同源克隆方法首次从草莓花芽cDNA中分离出APETALA2同源基因SAP2。SAP2全长182bp,编码435个氨基酸。序列分析表明,SAP2具有AP2家族典型的结构域。采用RT-PCR方法分析SAP2在不同组织中的表达情况,结果显示SAP2在草莓营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达,与拟南芥AP2、矮牵牛PhAP2A的表达模式一致。以上结果说明SAP2是草莓的AP2同源基因。     

大黄鱼CYP1A基因cDNA的克隆与表达分析

由于外源化合物能诱导鱼类CYPIA(P4501A)的表达,因而它广泛被用作评价水环境污染生物标记物.利用RT-PCR结合RACE技术从大黄鱼(Larimichthys crocea)肝脏克隆了CYP1A基因全长cDNA序列.经分析,该cDNA的5'末端有175 bp的非翻译区.开放阅读框为1 566 bp,编码521个氨基酸和一个终止密码子,3'末端有857 bp的非翻译区,3'非翻译区有一个多聚腺苷酸信号及两个与mRNA的快速降解有关的AUUUA序列.推测大黄鱼CYP1A的氨基酸序列和欧洲鲈鱼的相似度最高迭89.6%.用RT-PCR检测大黄鱼CYP1A的表达特征发现,在所检测的9个组织中均有表达,以肝脏、消化道、脾脏和肾脏的表达量较高.