Chelex-100快速提取用于转基因检测DNA模板的研究

目的:建立从转基因作物中快速提取DNA的方法.方法 :采用Chelex-100法提取抗草甘膦大豆和非转基因大豆、转基因抗虫玉米Bt176和非转基因玉米中的DNA,使用PCR扩增大豆和玉米的内源基因(Lectin,zSSⅡb)及外源特异性序列(CaMV35S,Bt176)评价提取核酸的质量.结果 :Chelex-100法能够快速在1h之内从大豆和玉米中提取DNA,所提取的DNA可以直接用于PCR扩增反应,PCR扩增产物电泳条带清晰,转基因抗草甘膦大豆样品和转基因抗虫玉米Bt176检测均出现强阳性结果.结论 :Chelex-100法提取DNA可以作为转基因检测的模板,该方法具有经济、简便、快速的特点,适合于转基因检测工作.     

从土壤中提取DNA用于PCR扩增*

设计、比较了5种直接从土壤中提取DNA的方法。实验结果表明这5种方法都可以从土壤中提取到长度大于15kb的DNA片段,但在不同方法间DNA的产量存在很大差异;初提的土壤DNA经进一步提纯后均可用于PCR反应,利用细菌16S rRNA基因和抗菌肽Shiva-1基因的引物都得到了相应的目的产物。其中方法5提取DNA产量最高,无明显降解,且重复性好,是一种从小量土壤样品中直接提取DNA的理想方法。     

从土壤中提取DNA用于PCR扩增

设计、比较了5种直接从土壤中提取DNA的方法。实验结果表明这5种方法都可以从土壤中提取到长度大于15kb的DNA片段,但在不同方法间DNA的产量存在很大差异;初提的土壤DNA经进一步提纯后均可用于PCR反应,利用细菌16S rRNA基因和抗菌肽Shiva-1基因的引物都得到了相应的目的产物。其中方法5提取DNA产量最高,无明显降解,且重复性好,是一种从小量土壤样品中直接提取DNA的理想方法。     

两种从土壤中提取DNA方法的比较

为土壤微生物多样性研究选取理想的DNA提取方法,该文比较了直接法和间接法从土壤中提取微生物总DNA的效果。结果表明：直接法提取量大,每克土壤提取到DNA约10．26μg,而间接法仅提取到0．55μg,直接法DNA提取量约为间接法的19倍。直接法得到的DNA包含细菌种群较间接法丰富,DGGE分析结果显示,二者的条带数分别为35条和28条,占检测条带总数的92．1%和78．9%。间接法提取到DNA纯度较直接法高,不需纯化即可用于PCR扩增和BamHⅠ酶切反应。     

改良Chelex-100法快速提取转基因农产品DNA

旨在建立一种从转基因农产品中快速提取DNA的方法.分别采用改良Chelex-100法和常规CTAB法提取转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA,测其浓度和纯度,PCR扩增其内源基因(Lectin)、启动子(CaMV35S)和品系特异性序列,对两种方法进行比较和评价,并研究两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的检测效果,以及改良Chelex-100法在玉米、小麦和水稻等其他转基因农产品的应用效果.结果表明,改良Chelex-100法能够快速在1.5h之内从样品中提取DNA,所提取的DNA直接用于PCR扩增反应,产物电泳条带清晰明亮.两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的检测效果未见明显差别.该方法在玉米、小麦和水稻等转基因农产品的应用效果稳定.因此,改良Chelex-100法提取的DNA可以作为PCR扩增模板用于转基因农产品检测.该方法具有经济、简便、快速、安全的特点,适合转基因农产品大规模筛选和鉴别.     

从土壤中提取DNA方法比较

设计并比较了3种直接从土壤中提取DNA的方法。试验结果表明:3种方法都可以从土壤中提取到分子量大于23.13 kb的DNA的片段,每克干土DNA的提取量为2.5~31μg,不同方法间在DNA产量、纯度等方面存在较大差异。     

土壤微生物总DNA的提取和纯化

本文建立了从土壤中提取总DNA的方法,并通过改进使适合于对革兰氏阳性菌的提取。用9种性质不同的土壤进行验证,均提取到了DNA,每克干土的DNA提取量从3.30μg～13.41μg,通过透析袋回收进行纯化,纯化回收率达到65.34%,纯化后的土壤DNA可以直接扩增出16S rDNA。9种土壤的提取率从60.51%～93.45%,可以从每g干土添加362个菌体的土壤中扩增到目的条带。     

湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术

DNA分子生物学技术的广泛应用,为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA的方法,即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA过程中采用氯化钙去除腐殖酸,DNA提取缓冲液中不使用EDTA螯合剂,提取过程用时4h左右。与其他两种方法相比,该方法高效去除湿地土壤腐殖酸,纯度较高,满足PCR扩增,为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA提取和纯化技术。     

转基因甘蔗对根际土壤微生物多样性的影响

应用Biolog法研究了转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因甘蔗对根际土壤微生物多样性的影响。结果表明:转基因甘蔗根际土壤微生物利用单一碳源能力(AWCD)要高于非转基因甘蔗的根际土壤微生物;转基因甘蔗和非转基因甘蔗根际上壤样品的Simpson指数(1/D)、Shannon-Wiener指数(H)、Mclntosh指数(U)均存在差异,其中转基因甘蔗根际土壤微生物的Simpson指数显著高于非转基因甘蔗土壤微生物,两种土壤微生物群落优势度的差别很大,其次是Mclntosh指数(U)指数,丰富度的差别不是很大。说明转基因甘蔗根系在生长期的分泌物刺激根际土壤微生物群落的生长,可能诱导了具有某些特定生理特征的微生物群落的发展,因此转基因甘蔗对根际土壤微生态有一定的影响。     

棉花根际促生菌基因组DNA的提取及其鉴定

植物根际微生物基因组的提取往往因为细胞壁不能完全裂解以及内含物的成分和含量受到影响,获得完整的基因组DNA一直是土壤微生物分子生物学研究的关键。本文以新疆盐碱地棉花根际促生菌为材料,比较了SDS法、CTAB法以及高盐结合的CTAB法提取棉花根际促生菌基因组DNA的效率,结果显示,SDS法和CTAB法在细胞裂解后,由于过多的多糖类物质混于上清液中使其过于粘稠而无法分层,没能得到DNA样品。高盐结合的CTAB法则有效弥补了上述方法的不足,能够获得A260/A280为1.82、A260/A230为2.43的高质量基因组DNA。同时实验还以细菌16SrDNA为内标进行PCR扩增,结果证明所获得的棉花根际促生菌基因组DNA可直接用于PCR等分子生物学进一步研究。     

种植转Bt基因棉土壤中Bt蛋白的分布

采用盆栽试验结合酶联免疫法(ELISA)测定了转Bt基因抗虫棉及常规棉花不同生育期根际及非根际土壤中的Bt蛋白含量.结果表明:红壤、黄棕壤及黄褐土种植转Bt基因棉花后根际土中Bt蛋白含量显著高于非根际土,而种植常规棉花的根际土与非根际土中Bt蛋白含量差异不显著.在初蕾期转Bt基因棉根际土中的Bt蛋白含量为黄褐土＞黄棕壤＞红壤,分别为常规棉根际土的144%、121%和238%;而在盛花期为黄棕壤＞黄褐土＞红壤,分别为常规棉根际土的156%、116%和197%.无论种植转Bt基因棉还是常规棉,供试土壤的根际和非根际土中Bt蛋白含量都随棉花生育期的推进先增加后减少,在盛花期达最大值.整个生育期内,转Bt基因棉根际土中的Bt蛋白含量大于其非根际土;种植转Bt基因棉土壤中Bt蛋白含量高于常规棉,说明转Bt基因棉花的Bt蛋白可释放到根际土中.     

利用根箱法解析转基因抗虫棉花重组DNA在土壤中的分布

利用根箱法对转基因抗虫棉花根部土壤进行分区采集,并采用新建立的土壤中转基因抗虫棉花重组DNA的半定量PCR检测方法对转基因抗虫棉花3个生长时期(播种后40、50和60d)不同根区土壤中内参磷酸果糖激酶(PFK)基因片段、35S-Cry1A构建特异性片段和35S-NPTII构建特异性片段进行分析,探索转基因抗虫棉花重组DNA在土壤中的分布特点。结果表明:播种后第40天、第50天的全部根表、根际及1个非根际土壤样品中检测到磷酸果糖激酶基因片段,第60天的全部土壤样品中检测到磷酸果糖激酶基因片段;第40天、第50天各有2个根表和1个根际土壤样品中检测到35S-Cry1A构建特异性片段,而非根际土壤样品中未检测到35S-Cry1A构建特异性片段,第60天的全部根表、根际及1个非根际土壤样品中检测到35S-Cry1A构建特异性片段,35S-Cry1A构建特异性片段相对量变化与磷酸果糖激酶基因片段基本一致;第40天、第50天和第60天全部根表土壤样品和第60天全部根际土壤样品中检测到35S-NPTII构建特异性片段,而在其他土壤样品中各有2个检测到35S-NPTII构建特异性片段,35S-NPTII构建特异性片段相对量变化与35S-Cry1A构建特异性片段基本一致;35S-Cry1A和35S-NPTII构建特异性片段与内参磷酸果糖激酶基因片段在土壤中的分布特点相似,主要分布在根表和根际土壤中,并随着棉花生长期的推进分布范围逐渐扩大。     

Effects of repeated cultivation of transgenic Bt cotton on functional bacterial populations in rhizosphere soil

The impact of multiple-year (0–5 years) cultivation of transgenic Bacillus thuringiensis (Bt) cotton on the functional bacterial populations in rhizosphere soil was investigated. The transgenic Bt + CpTI cotton line SGK321 and a non-Bt cotton line Shiyuan321 were planted in four fields in which Bt cotton had been continuously cultivated for 0, 1, 3, and 5 years. Rhizosphere soil samples were collected at the seedling, squaring, flower and boll, and boll-opening stages of cotton. Numbers of bacteria involved in nitrogen-fixing, organic phosphate-dissolving, inorganic phosphate-dissolving, and potassium-dissolving were measured with cultivation-dependent approaches. The data presented here showed no consistent statistically significant differences in the numbers of different groups of functional bacteria between rhizosphere soil of Bt and non-Bt cotton in the same field, and no obvious trends in the numbers of the various group of functional bacteria with the increasing duration of Bt cotton cultivation. These studies suggest that multiple-year cultivation of transgenic Bt cotton may not affect the functional bacterial populations in rhizosphere soil.     

转基因棉花种植对根际土壤微生物群落功能多样性的影响

应用Biolog方法对两种转基因棉花及其亲本非转基因棉花根际土壤微生物的单一碳源利用水平进行了比较分析,探讨转基因棉花种植对其根际土壤微生物群落功能多样性的影响.结果表明：与非转基因亲本相比,在苗期、蕾期、吐絮期、衰老期转基因棉花种植对根际土壤微生物群落碳源利用能力、Shannon功能多样性指数和均匀度指数的影响均不显著,而在花铃期根际土壤微生物群落碳源利用能力和Shannon功能多样性指数显著降低.主成分分析表明,花铃期转基因棉花与非转基因棉花根际土壤微生物碳源利用在两主成分轴上的分异较大,碳源利用模式差异显著.     

转Bt基因抗虫棉根际微生物区系和细菌生理群多样性的变化

在大田栽培条件下 ,以转 Bt基因抗虫棉 GK-12和常规棉花泗棉 3号作为材料 ,在棉花不同发育时期 ,于 2 0 0 1和 2 0 0 2连续两年测定棉花根际土壤细菌、放线菌和真菌数量的变化 ,并在 2 0 0 2年棉花的花铃期和吐絮期对根际细菌生理群的数量和多样性进行了分析 ,结果表明 :虽然不同年份和生育期棉花根际微生物数量存在差异 ,但是 ,年度间和相同的发育时期棉花根际微生物的数量变化趋势一致。在棉花的苗期和吐絮期 ,转 Bt基因抗虫棉根际微生物的数量与对照差异不显著 ;在棉花的花铃期 ,转 Bt基因抗虫棉根际细菌的数量比对照增加 ,放线菌的数量差异不显著 ,而真菌的数量变化没有规律。在棉花发育的花铃期和吐絮期 ,Bt棉根际细菌生理群的总数量比常规棉增加 ,但是根际细菌生理群的 Simpson指数、Shannon-Wiener指数和细菌生理群分布的均匀度下降     

不同生育期转Bt基因棉种植对根际土壤微生物的影响

 在盆栽种植条件下,比较研究了两个转Bt基因棉(Gossypium hirsutum)与对照棉对根际土壤细菌、放线菌、真菌和主要功能类群及多样性的影 响差异。结果表明：两个转Bt基因棉根际土壤均可检测到Bt蛋白,且不同转Bt基因棉根系分泌Bt蛋白量以及Bt蛋白在根际土壤中的降解率不同 。与各自对照相比,转Bt基因棉对细菌和真菌生长繁殖有促进作用,对放线菌、好气固氮菌和钾细菌数量没有显著影响。苗期和花期转Bt基因 棉均可显著提高氨化细菌、显著降低无机溶磷菌数量,花期均可显著提高好气纤维分解菌、显著降低有机溶磷菌数量,‘Bt冀668’苗期也可显 著提高好气纤维分解菌数量。转Bt基因棉根际土壤好气纤维分解菌、有机和无机溶磷菌多度发生了变化。尽管功能类群总数转Bt基因棉高于各 自对照常规棉,但群落多样性和均匀度都有所下降,优势集中性表现明显,且花期转Bt基因棉多样性参数值以及功能类群数量的变化幅度大于 苗期。     

种植转Bt基因抗虫棉对土壤生物学活性的影响

采用温室盆栽实验,研究了种植转Bt基因棉（苏抗103）和同源常规棉（苏棉12）对根际土壤生物学活性的影响。结果表明：与对照常规棉相比,种植转Bt基因棉对根际土壤脱氢酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶和土壤呼吸的影响因生育期而异,土壤脲酶、蛋白酶和微生物量C在各生育期均没有显著差异;土壤蔗糖酶、土壤脱氢酶和土壤呼吸分别只在苗期（苏抗103〉苏棉12,增幅为25．5％）、花铃期（苏抗103〉苏棉12,增幅为21．6％）、花铃期（苏抗103〉苏棉12,增幅为36．1％）存在显著差异;土壤磷酸酶在花铃期和吐絮期活性显著下降（降幅分别为22．1％和32．9％）。     

Transgenic Bt cotton has no apparent effect on enzymatic activities or functional diversity of microbial communities in rhizosphere soil

A transgenic Bt cotton (Sukang-103) and its non-Bt cotton counterpart (Sumian-12) were investigated to evaluate the potential risk of transgenes on the soil ecosystem. The activities of urease, phosphatase, dehydrogenase, phenol oxidase, and protease in cotton rhizosphere were assayed during the vegetative, reproductive, and senescing stages of cotton growth and after harvest. A Biolog system was used to evaluate the functional diversity of microbial communities in soils after a complete cotton growth cycle. Enzymatic activities in soils amended with cotton biomass were also assayed. Results showed that there were few significant differences in enzyme activities between Bt and non-Bt cottons at any of the growth stages and after harvest; amendment with cotton biomass to soil enhanced soil enzyme activities, but there were no significant difference between Bt and non-Bt cotton; the richness of the microbial communities in rhizosphere soil did not differ between Bt and the non-Bt cotton, and close to that of control soil; the functional diversity of microbial communities were not different in rhizosphere soils between Bt and non-Bt cotton. All results suggested that there was no evidence to indicate any adverse effects of Bt cotton on the soil ecosystem in this study.     

转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花对土壤细菌种群多样性的影响

以转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花为研究对象,非转基因受体棉花为对照,通过比较可培养细菌数量和基于16S rRNA克隆文库细菌种群分析,评价外源双价基因的导入在苗期、蕾期、花铃期和吐絮期对棉花根际细菌群落多样性的影响。结果表明,可培养细菌的数量不受外源双价基因的影响,随着棉花生育期的交替而变化,以代谢旺盛的花铃期最多。构建的转基因和非转基因不同生育期根际土壤细菌16S rRNA文库容量为2400个克隆,涵盖了细菌的283个属。其中,Acidobacterium是最大优势类群,共包括624个克隆,其次为未知细菌种群和Flavisolibacter。比较转基因和非转基因棉花根际土壤细菌的种群结构,结果显示,同一生育期内前者种群的多样性显著低于后者,二者的共有类群随着生长发育的进行而增多。研究结果说明几丁质酶基因和葡聚糖酶基因对棉花根际细菌种群多样性有着不同程度的削减作用,但是随着种植时间的延长,该差异呈现逐渐缩小的趋势。     

套作棉根际与非根际土壤酶活性和养分的变化

在棉麦两熟双高产条件下研究了棉花根际与非根际土壤酶活性和养分含量的变化.结果表明,套作棉土壤脲酶、蔗糖酶、蛋白酶及过氧化氢酶活性随生育进程的变化趋势与单作棉表现一致,但整个生育期套作棉根际与非根际土壤各种酶活性均明显高于单作棉.套作棉根际与非根际土壤养分含量在麦棉共生期低于单作棉或差异较小,而在麦收后则显著高于单作棉.套作棉土壤养分含量随生育进程的变化趋势与单作棉大体相同,但一些养分的吸收高峰晚于单作棉.无论套作棉还是单作棉,根际土壤酶活性和养分含量高于非根际.土壤各养分含量与土壤脲酶、蔗糖酶和蛋白酶活性呈显著(P=0.0,n=32)或极显著(P=0.01,n=32)相关,与土壤过氧化氢酶活性相关不显著.