三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR 方法获取了3株广西地方强毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因组序列,并对其进行了比较分析.此3株病毒的全基因组序列均由15192个碱基组成,与GenBank公布的ZJ1、U.S/Largo/71、Italy/2736/00等7个毒株的全基因组序列长度相同,比LaSota、Clone-30和B1的全基因组序列多出6个核苷酸,此6个核苷酸位于np基因的非编码区内,相对与NDV毒株LaSota、Clone-30和B1序列的1647～1648nt 位.通过序列的比较分析,发现GX7/02、GX9/03和GX11/03与ZJ1毒株的同源性较高,而与LaSota、Clone-30和B1等毒株的同源性较低.     

鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组的序列测定

依据GenBank上公布的新城疫病毒(NDV)的基因序列,自行设计了9对引物,运用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)获取覆盖NDV鹅源毒株ZJ1株全基因组的部分重叠片段。病毒RNA的5’及3’端的序列由cT)NA末端快速扩增技术(RACE)获取。整个病毒基因组序列由15192个碱基组成,比GenBank上公布的其它4个NDV毒株Beaudettec、B1、Lasota及Clone-30的全基因组序列长6个核苷酸。这6个核苷酸位于核衣壳蛋白(NP)基因内,相对于NDV毒株Lasota株全基因序列的1647nt～1648nt位。其它10个NDV毒株中的9个毒株也被验证具有此特征,且它们分属于3个不同的基因型。     

三株新城疫病毒强毒株的生物学特性及全基因组序列分析

2009～2011年从北方发病鸡群和鸭群中分离出3株新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）。通过致病性指数测定及交叉血凝抑制试验初步分析了3个毒株的毒力和相互之间的同源性。选取鸡源分离株SDLY01与新城疫疫苗株（LaSota）进行了交叉保护试验,选取鸭源毒株SD03对樱桃谷鸭进行攻毒实验,同时设计引物对3个毒株进行了全基因组测序,并与36株NDV参考株进行了分子进化分析。结果表明3个分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117符合强毒株的序列特征,并与致病性指数测定结果相符。交叉血凝抑制试验发现3个分离株与疫苗株LaSota 的抗原同源性较低为82.5%～89.4%,两个鸡源分离株间的抗原同源性为90%,而鸭源毒株SD03与鸡源毒株SDSG01同源性为100%。交叉保护试验和攻毒实验结果显示传统的LaSota疫苗能对SDLY01流行株提供100%免疫保护,但第5天仍检测到排毒;鸭源毒株SD03对樱桃谷鸭不致病,但能检出排毒,排毒期最长为5d。全基因组测序与分析表明3个毒株基因组长度均为15192bp,属于基因Ⅶd型毒株,与同期流行的鹅源及鸭源NDV毒株之间全基因组核苷酸序列具有高度的同源性,揭示鸭源、鹅源NDV与鸡源NDV在遗传学和流行病学上密切相关。     

一起无菌性脑膜炎疫情中埃可病毒30型的全基因组分析

对引起一起无菌性脑膜炎的埃可病毒30型（（Echovirus 30,E30）毒株进行全基因组测序,并分析其遗传变异和分子进化特征。提取病毒RNA,荧光RT-PCR确定为肠道病毒,再扩增其VP1区,测序确定为E30,设计针对E30全基因组的引物,RT-PCR扩增和序列测定获得全基因序列。利用DNAMAN 9.0、MEGA X、RDP 5和SimPlot 3.5.1软件分析全基因序列。E30无锡株基因组全长7 425 bp个核苷酸（nt）,5′端和3′端分别为743 nt和97 nt的UTR,二个UTR之间为一个6 585 nt长的开放阅读框,编码一个含2 195个氨基酸（aa）的多聚蛋白。与GenBank中基因组序列比对,最同源的是毒株USA/2017/CA-RGDS-1048 （基因登录号：MN153801）,核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为99.1%。VP1基因进化树分析显示,E30无锡株属于h型,并可归类于h型下分的基因簇GroupⅣ。种系进化分析和同源性分析提示E30无锡株可上溯到中国江苏毒株FDJS03毒株。分析还发现E30无锡株在非结构区存在重组,重组序列可能来自E3...     

鸭肠炎病毒UL6基因的分子特征

为了研究鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)UL6的特征,以DEV Clone-03株基因组DNA为模板,用靶基因步移PCR方法扩增得到UL6基因区域2534 bp的DNA片段。结果发现,DEV Clone-03 UL6基因由2373个核苷酸组成,编码一条790个氨基酸残基组成的多肽。与14株已报道的具有全UL6同源基因序列的疱疹病毒参考株进行比较,DEV Clone-03株与α疱疹病毒的核苷酸和氨基酸同源性较之与β疱疹病毒和γ疱疹病毒要高。氨基酸序列比较显示,DEV Clone-03 UL6基因具有α疱疹病毒UL6同源基因5个保守区域。UL6基因推导的氨基酸系统发育进化树分析发现,DEV Clone-03与α疱疹病毒属一个群,在α疱疹病毒中与马立克氏病病毒(Marek′sdisease herpesvirus,MDV)更接近。同时,序列分析发现,在201~222和425~441等氨基酸位,α疱疹病毒参考毒株均有不同程度的缺失,而DEV Clone-03表现出独有的完整性。     

两株基因III型强毒新城疫的全基因组测序及其与I系苗的亲缘性分析

[目的]研究基因Ⅲ型新城疫(Newcastle disease,ND)强毒分离株Js/7/05/Ch和JS/9/05/Go与中等毒力疫苗株Mukteswar的亲缘性关系,分析三株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的全基因差异.[方法]采用RT-PCR方法获得两株NDV分离株的全基因组核苷酸序列,与GenBank中公布的Mukteswar序列比对分析.[结果]强毒分离株与中等毒力疫苗株Mukteswar全基因组核苷酸同源性均为99.7%;病毒6个阅读框核苷酸序列与Mukteswar同源性为99.6%～99.9%;预测的8种病毒编码蛋白同源性在98.8%～99.8%.然而,测定MDT,ICPI和IVPI发现JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go毒力明显强于Mukteswar,其中JS/7/05/Ch株的IVPI达到了2.18.[结论]综合3株NDV的遗传分析结果和已有的流行病学资料可以推断分离株JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go是由疫苗株Mukteswar自然进化而来的返强毒株.因此,必须停止使用中等毒力疫苗以免造成更大的危害.     

鸡传染性支气管炎病毒变异株(793/B)核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV 793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析.结果表明,IBV 793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV 793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失.N基因的核苷酸同源性为86.9%～91.4%,氨基酸同源性为75.8%～77.5%.表明IBV 93/B的N基因存在着较大的变异性.     

鸡传染性支气管炎病毒变异株（793／B）核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析。结果表明,IBV793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失。N基因的核苷酸同源性为86.9%～91.4%,氨基酸同源性为75.8%～77.5%。表明IBV93/B的N基因存在着较大的变异性。     

山羊关节炎脑炎病毒甘肃株全基因组克隆和序列分析

根据GenBank中发表的山羊关节炎脑炎病毒CAEV-CO株（caprine arthritis encephalitis virus-CO,CAEV-CO）的全基因组序列（序列号：NC-001463）,设计合成了7对引物,对CAEV甘肃株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果表明,CAEV-甘肃株基因组全长为9186nt。与国际标准毒株CAEV—CO株相比,在编码区有12个碱基的缺失,二者的核苷酸同源性为91．0％;在非编码区有27个核苷酸的插人,核苷酸同源性为97．0％。gag、pol、蛋白Q、tat、env基因编码的氨基酸同源性分别为94．6％、94．7％、87．9％、94．7％和91．5％。     

Artificial recombination may influence the evolutionary analysis of Newcastle disease virus

The recombination rate in Newcastle disease virus (NDV) was as high as 10% in RDP analysis with full-length NDV genome sequences available in GenBank. We found that two NDV strains, China/Guangxi09/2003 and NDV/03/018, previously reported as recombinants, failed to show any evidence of recombination upon complete genome resequencing. Furthermore, we were able to reproduce artificial recombination by amplification of the M gene in a mixed sample of strains LaSota and ZJ1. It appears that the recombination of NDV is not as common as has been reported. NDV sequences in GenBank should be analyzed with caution during bioinformatic analyses for natural recombination events.     

鹅新城疫病毒P基因的RNA编辑及其相关蛋白的分子特征

应用RT-PCR方法对鹅新城疫病毒安徽分离株WF00GP基因进行了RNA编辑分析,发现w‰GP基因在保守的编辑位点上插入一个G,使得P基因增加编码V蛋白,而且它的最大ORF的长度为1188bp,编码395个氨基酸的P蛋白。wkG株和参考毒株的P基因的同源性和系统发育分析表明,WF00G株与水禽源毒株NA．1、ZJ1、FPI／02、PX2／03、Duck／1／05和SF02等亲缘关系较近,与传统疫苗株或弱毒株HB92、LaSota和Clone30以及F48E9等的亲缘关系相对较远。进一步对其V蛋白羧基端序列分析发现,虽然编辑位点氨基酸序列（132KKG134）和羧基端的5个Cys残基位点是高度保守的,但是V蛋白c末端氨基酸存在较大变异,APMV-1毒株V蛋白羧基端氨基酸的突变呈现“基因型一致性”。     

新城疫分离毒HN基因的分子特性和片段同源相关性

选取国内1997-2005年分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)24株,经蚀斑纯化克隆其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,与在GenBank发表的36株国内外不同时期的NDV毒株,进行氨基酸遗传变异分析,并利用SPSS8.0软件对其不同片段的氨基酸进行同源相关比较。结果显示:国内所有NDV分离毒株氨基酸高度同源,同源性为94.4%-99.4%;与LaSota、Clone30疫苗株等的氨基酸同源性为86.9%-89%;与强毒株F48E9的氨基酸同源性为87.9%-89.9%;与国外NDV的氨基酸同源性为87.2%-96.2%。系统发育分析表明:国内NDV分离毒HN遗传距离较近,而与LaSota、Clone30和F48E9遗传距离较远。国内NDV分离毒均缺乏538-540位糖基化位点。不同片段与全长的氨基酸同源性高度相关,且与前80个氨基酸相关最密切。     

鹅副粘病毒SF02 F基因的序列分析及SF02的多重RT—PCR鉴别

对新近分离的鹅副粘病毒SF0 2采用RT PCR方法 ,扩增F基因后测序 ,得到全长的F基因。该基因的ORF总长为 16 6 2nt,编码 5 5 3个氨基酸 ,其裂解位点的序列为112 R R Q K R F117,与新城疫病毒强毒株的特征相符。其核苷酸和氨基酸同源性分析 ,并与国内新城疫病毒标准强毒株F4 8E9相比较 ,表明该毒株在F基因上已发生了较大的变异 ,而与近年来在我国台湾和部分西欧国家流行的禽副粘病毒有很高的亲缘关系。在分析F基因序列的基础上 ,设计 3条引物 ,建立了一种新的多重RT PCR方法 ,能区分鸡新城疫病毒与鹅副粘病毒。     

新城疫病毒HN基因的遗传变异与HI相关性的研究

选取国内1999~2004年分离的新城疫野毒10株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,对其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因分别进行克隆和测序,结合在GenBank中发表的LaSota、F48E9和Clone30等参考序列,对其氨基酸序列进行遗传变异分析,绘制系统发育树。利用SPF鸡在隔离器中分别制备上述NDV毒株的单因子阳性血清,进行血凝抑制(HI)交叉试验,计算NDV不同株之间的HI相关系数(r)。利用统计学软件SPSS8.0对NDV不同株之间的HN氨基酸同源率和HI相关系数(r)进行相关比较。结果表明:NDV野毒间氨基酸高度同源,同源性为96.5%~99.8%,而与LaSota、F48E9和Clone30同源率仅为87.4%~89.9%;所有野毒均缺乏1个潜在的糖基化位点;HN基因的氨基酸同源性与HI相关系数显著相关(P<0.01,r=0.55)。     

四株不同宿主来源的Class I基因3型新城疫病毒全基因组序列测定及比较分析

为了解析基因型相同但宿主来源不同的新城疫病毒的全基因组差异。本文采用RT-PCR方法分别获得4株（JS/3/09/Ch,ZJ/3/10/Ch,AH/2/10/Du,JS/9/08/Go）Class I 基因3型病毒的全基因组核苷酸序列,并与GenBank中已公布的Class I基因3型病毒全基因组序列进行比对分析。本实验4株病毒的基因组长度均为15198bp,在基因组1607～1608位有6碱基的缺失,在2381～2382位有12碱基的插入,裂解位点为112EQ/RQE/GRL117是标准弱毒特征。5株Class I基因3型病毒之间全基因组同源性超过93%;而与Class II弱毒株同源性最低只有72.2%;比较6个结构蛋白基因的同源性,NP基因的同源性最高(98.3%～96.4%),而P基因最低(96.1%～91.9%)。结果表明不同宿主来源的Class I基因3型新城疫病毒在遗传信息方面差异不大,但NP/F/L基因的变异幅度较P/M/HN基因明显。     

简化cDNA末端快速扩增技术测定基因Ⅲ、Ⅵb和Ⅶ d型新城疫病毒基因组末端序列及分析

[目的]简化cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,fLAcE)流程,测定基因Ⅲ、VIb)和VIId型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因组两侧末端序列,并对NDV的leader和trailer进行分析.[方法]利用T4 RNA连接酶将特定寡聚核苷酸片段的连接于病毒基因组RNA和eDNA,再利用RT-PCR或PCR方法对病毒基因组的末端进行快速的扩增.[结果]建立一套操作简单、低成本、可重复性高的RACE方法,测定了三种基因型5株NDV 3'末端leader和5'末端trailer序列比对分析.[结论]本实验测定的鹅源VII型毒株JS/7/05/Ch基因组的15,184 nt由一个T变为了C,5'端trailer与3'端leader的连续互补序列由8 nt变为12 nt,而其它4株基因Ⅲ型和VI型NDV均未发现该突变.通过RNA的二级结构分析,NDV基因组和反向基因组RNA的3'末端形成一个发卡结构.JS/7/05/Ch等3株NDV U→C(T→C)的突变位于发卡环上,不影响二级结构的形成,发卡环的RNA序列突变为3'-UCUC-5',与基因组3'端发卡环的3'-UCUUA-5'相似,推测可能影响了基因组RNA的复制速度.     

Characterization and phylogenetic analysis of Varicella-zoster virus strains isolated from Korean patients

Varicella-zoster virus (VZV) is a causative agent of chickenpox in primary infection and shingles after its reactivation from latency. Complete or almost-complete genomic DNA sequences for various VZV strains have been reported. Recently, clinical VZV strains were isolated from Korean patients whose genome was sequenced using high-throughput sequencing technology. In this study, we analyzed single nucleotide polymorphism (SNP) of VZV strains to genetically characterize Korean clinical isolates. Phylogenetic analyses revealed that three Korean strains, YC01, YC02, and YC03, were linked to clade 2. Comprehensive SNP analysis identified 86 sites specific for the 5 VZV clades. VZV strains isolated from Korea did not form a phylogenetic cluster. Rather, YC02 and YC03 clustered strongly with Chinese strain 84-7 within clade 2, more specifically cluster 2a. Signature sequences for the cluster 2a were identified and found to play an important role in the separation of cluster 2a strains from other clade 2 strains, as shown in substitution studies. Further genetic analysis with additional strains isolated from Japan, China, and other Asian countries would provide a novel insight into the significance of two distinct subclades within clade 2.