狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

融合表达牛疱疹病毒1型VP22及猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组伪狂犬病毒TK-/gE-/VP22GP5+的构建

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRS)和伪狂犬病(pseudora-bies,PR)是两种严重危害养猪业的重要病毒性传染病。而引发PR的伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)是构建基因工程疫苗优良的活病毒载体[1]。已有报道将表达猪瘟病毒(hog cholera virus,HCV)囊膜蛋白E1基因的重组PRV(rPRV)二价基因工程疫苗免疫猪后,能同时抵抗HCV和PRV的强毒攻击[2],显示了PRV作为活病毒载体的可行性和“一针防两病”的独特优点。由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive …     

猪圆环病毒2型－细小病毒－伪狂犬重组病毒免疫小鼠试验研究

为了研究表达猪2型圆环病毒ORF2基因和猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒疫苗株SA215(D)的疫苗价值,对该病毒株安全性、免疫原性、保护力及对PRV Fa株定值进行了研究。研究结果表明重组病毒SA215（D）毒力显著低于PRV Fa强毒株,可以抵御伪狂犬病强毒Fa株的攻击,并能抵御其在小鼠体内的定植;抗体检测显示SA215（D）免疫小鼠后第2周抗PRV、PCV2和PPV的抗体水平均很低,加强免疫后第4周抗体水平大幅上升,且显著高于阴性对照组,而与阳性对照组无明显差异,表明SA215（D）可诱导小鼠产生体液免疫反应。淋巴细胞增殖试验显示SA215（D）可诱导小鼠产生较强的淋巴细胞增殖反应,与亲本株SA215组相比,差异显著(0.01     

表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

表达猪圆环病毒II型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

摘要:【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小 鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应

猪伪狂犬病毒（PRV）是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRV基因缺失疫苗株TK^-/gE^-/LacZ⁺为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK^-/gE^-/GP5⁺免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力,用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因（ORF5m）代替天然ORF5基因,构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK^-/gE^-/GP5m⁺。经PCR、Southern blot、Western blot 证实构建正确,并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TK^-/gE^-/GP5m⁺与TK^-/gE^-/GP5⁺分别免疫Balb/c小鼠,结果TK^-/gE^-/GP5m⁺免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体(3/6只达到了1∶16),而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK^-/gE^-/GP5⁺,表明TK^-/gE^-/GP5m⁺是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。     

伪狂犬病病毒TK-/gG-缺失株的构建及其生物学特性研究

将伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株的基因组DNA与含有缺失的gG基因的转移质粒pUSKBB共转染猪肾传代细胞PK-15,待完全病变后收获病毒进行空斑试验,用PCR筛选gG缺失的重组病毒。空斑纯化3次后,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的TK^-／gG^-缺失株。遗传稳定性试验表明该重组病毒能在PK-15细胞上稳定遗传,动物试验表明该缺失株对Balb／c小鼠极为安全且能保护Balb／c小鼠抵抗致死量PRV强毒的攻击。该突变株的获得为我国伪狂犬病的控制和根除奠定了基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨

以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK/gG-/LacZ 为亲本株,通过同源重组,构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK/gG-/GP5 .经PCR、Southern杂交、Western blot证实构建正确,并能表达GP5.同时,对重组病毒在PK-15细胞中的增殖特性进行了检测,结果与亲本株相比,增殖滴度无显著性差异.将重组病毒免疫BALB/c小鼠,2次免疫后4周,50%(3/6)小鼠产生了低水平的GP5特异性ELISA抗体,但中和抗体均小于1:4.     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应

为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2。利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2。分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRV HB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免。一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒。结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用。结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株。     

共表达猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒NJ-a株ORF4、ORF5与ORF6基因重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建

为探讨共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerep roductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)保护性抗原基因的重组改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankala,MVA)的免疫效力,将PRRSVNJ-a株ORF4、ORF5和ORF6基因插入转移载体pⅡLR中,获得了三基因共表达的转移载体pⅡLR-ORF5/ORF6/ORF4,通过同源重组的方法获得重组病毒rMVA-GP5/M/GP4。以lacZ为报告基因进行噬斑筛选和重组病毒纯化后,PCR方法证明ORF4、ORF5和ORF6成功的插入MVA基因组中;经Western blot检测与间接免疫荧光试验证实,重组病毒感染细胞能正确表达PRRSVGP4、GP5与M蛋白。用rMVA-GP5/M/GP4免疫6周龄Babl/C小鼠,首免后3周可检测到特异性PRRSV中和抗体,8周后中和抗体效价可达25,并能继续维持4周;淋巴细胞增殖试验结果表明,重组病毒免疫小鼠产生强烈的特异性细胞增殖反应。上述研究结果表明rMVA-GP5/M/GP4具有良好的免疫原性,可作为预防PRRS的候选疫苗进一步研究。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3基因的重组伪狂犬病病毒的构建

猪繁殖与呼吸综合征 (porcinereproductiveandrespiratorysyndrome ,PRRS)是引起怀孕母猪早产、流产、死胎及仔猪呼吸系统疾病的一种新发现的病毒性传染病[1] .该病毒的基因组为单股正链RNA ,约15kb ,含有 8个开放阅读框架 (ORFs) ,ORF1编码病毒非结构蛋白 (依赖RNA的RNA聚合酶 ) ,ORF2 ORF7编码病毒的结构蛋白 .其中ORF3含有 2 6 5个氨基酸 ,编码的GP3蛋白为高度糖基化的结构蛋白 ,有 7个糖基化位点 ,具有免疫原性[2 ,3 ] .目前 ,用于预防PRRS的疫苗主要是弱毒苗和灭活苗 ,虽然都有一定的免疫效果 ,但由于PRRS抗体依赖性…     

Construction and immunogenicity of recombinant pseudorabies virus expressing the modified GP5m protein of porcine reproduction and respiratory syndrome virus

Pseudorabies virus (PRV),an alpha-herpesvirus,has been developed as a live viral vector for animal vaccines.However,the PRV recombinant virus TK-/gE-/GP5+expressing GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),based on the PRV genetically depleted vaccine strain TK-/gE-/LacZ+,scarcely stimulated the vaccinated animals to produce neutralizing antibodies against PRRSV.To develop a booster-specific immune response of such PRV recombinants,the ORF5m gene (the modified ORF5 gene having better immune responses)was substituted for the ORF5 gene and introduced into PRV TK-/gE-/LacZ+,resulting in a PRV recombinant named TK-/gE-/GPSm+,which expressed the modified GPSm protein.The recombinant virus was confirmed using PCR,Southern blotting and Western blotting.TK-/gE-/GPSm+and TK-/gE-/GP5+expressing the authentic GP5 protein were inoculated into Balb/c mice to evaluate their immune responses.The results indicated that the protecting neutralization antibodies (the 3/6 vaccinated mice obtained 1:16)and cell immune responses induced by TK-/gE-/GPSm+against PRRSV were higher than that induced by TK-/gE-/GP5+.Thus,the development of the new PRV recombinant expressing the modified GP5m protein as a candidate vaccine established the basis for the study of bivalent genetic engineering vaccines against PRRSV and PRV.     

共表达PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中.为了增强免疫效果,在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位(PADRE),在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒(PrV)UL49基因,获得了6种重组质粒.间接免疫荧光试验显示,PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达,将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测血清抗体水平,通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫.结果显示,除pSFV1CS组外,从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体;各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能诱导特异性的淋巴细胞增殖:部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组.结果表明,这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,PrV UL49可以增强其细胞免疫应答.     

整合猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的重组鼠白血病病毒特性

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒完整的GP5基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果与已经登陆GenBank 的EF488048高致病性江西株比对分析表明碱基同源性达98.7%。构建含GP5基因的真核表达载体pcDNA-GP5, 通过与鼠白血病病毒(MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111共转染人胚肾细胞293T, 48 h后收集假病毒上清, 超离后通过Western-blot证明GP5蛋白在假型病毒颗粒表面存在, 表明GP5蛋白被整合到此假型病毒粒子表面。通过感染293T、Mark-145不同的靶细胞,证实所构建的假型病毒粒子具有感染性。成功构建了具有感染性的MuLV-GP5假病毒体系, 为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

整合猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的重组鼠白血病病毒特性

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒完整的GP5基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果与已经登陆GenBank 的EF488048高致病性江西株比对分析表明碱基同源性达98.7%。构建含GP5基因的真核表达载体pcDNA-GP5, 通过与鼠白血病病毒(MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111共转染人胚肾细胞293T, 48 h后收集假病毒上清, 超离后通过Western-blot证明GP5蛋白在假型病毒颗粒表面存在, 表明GP5蛋白被整合到此假型病毒粒子表面。通过感染293T、Mark-145不同的靶细胞,证实所构建的假型病毒粒子具有感染性。成功构建了具有感染性的MuLV-GP5假病毒体系, 为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

Construction and immunogenicity of recombinant pseudorabies virus expressing the modified GP5m protein of porcine reproduction and respiratory syndrome virus

Pseudorabies virus (PRV), an alpha-herpesvirus, has been developed as a live viral vector for animal vaccines. However, the PRV recombinant virus TK⁻/gE⁻/GP5⁺ expressing GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), based on the PRV genetically depleted vaccine strain TK⁻/gE⁻/LacZ⁺, scarcely stimulated the vaccinated animals to produce neutralizing antibodies against PRRSV. To develop a booster-specific immune response of such PRV recombinants, the ORF5m gene (the modified ORF5 gene having better immune responses) was substituted for the ORF5 gene and introduced into PRV TK⁻/gE⁻/LacZ⁺, resulting in a PRV recombinant named TK⁻/gE⁻/GP5m⁺, which expressed the modified GP5m protein. The recombinant virus was confirmed using PCR, Southern blotting and Western blotting. TK⁻/gE⁻/GP5m⁺ and TK⁻/gE⁻/GP5⁺ expressing the authentic GP5 protein were inoculated into Balb/c mice to evaluate their immune responses. The results indicated that the protecting neutralization antibodies (the 3/6 vaccinated mice obtained 1:16) and cell immune responses induced by TK⁻/gE⁻/GP5m⁺ against PRRSV were higher than that induced by TK⁻/gE⁻/GP5⁺. Thus, the development of the new PRV recombinant expressing the modified GP5m protein as a candidate vaccine established the basis for the study of bivalent genetic engineering vaccines against PRRSV and PRV. Translated from Journal of Biotechnology, 2005, 21(6): 858–864 [译自: 生物工程学报]     

Nsp2 and GP5-M of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Contribute to Targets for Neutralizing Antibodies

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) is characterized by its genetic variation and limited cross protection among heterologous strains. Even though several viral structural proteins have been regarded as inducers of neutralizing antibodies(NAs) against PRRSV, the mechanism underlying limited cross-neutralization among heterologous strains is still controversial. In the present study, examinations of NA cross reaction between a highly pathogenic PRRSV(HP-PRRSV) strain, JXwn06, and a low pathogenic PRRSV(LP-PRRSV) strain, HB-1/3.9, were conducted with viral neutralization assays in MARC-145 cells. None of the JXwn06-hyperimmuned pigs' sera could neutralize HB-1/3.9 in vitro and vice versa. To address the genetic variation between these two viruses that are associated with limited crossneutralization, chimeric viruses with coding regions swapped between these two strains were constructed. Viral neutralization assays indicated that variations in nonstructural protein 2(nsp2) and structural proteins together contribute to weak cross-neutralization activity between JXwn06 and HB-1/3.9. Furthermore, we substituted the nsp2-, glycoprotein2(GP2)-,GP3-, and GP4-coding regions together, or nsp2-, GP5-, and membrane(M) protein-coding regions simultaneously between these two viruses to construct chimeric viruses to test cross-neutralization reactivity with hyperimmunized sera induced by their parental viruses. The results indicated that the swapped nsp2 and GP5-M viruses increased the neutralization reactivity with the donor strain antisera in MARC-145 cells. Taken together, these results show that variations in nsp2 and GP5-M correlate with the limited neutralization reactivity between the heterologous strains HP-PRRSV JXwn06 and LP-PRRSV HB-1/3.9.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达

对杆状病毒BactoBac表达系统的转座质粒pFastbac1进行改造,即在其多角体蛋白启动子下游插入谷胱苷肽S转移酶（glutathioneStransferase, GST）基因,构建GST融合表达转座质粒pFGST。通过转座和转染Sf9细胞,证实该系统能高水平表达GST。采用PCR方法从pMTgp51质粒中扩增截去N端信号肽序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株ORF5基因,并将截短的ORF5基因片段克隆到pFGST中,使之与GST融合,构建的重组转座质粒pFGST53转染DH10Bac,提取大分子Bacmid DNA,转染Sf9细胞,获得能表达融合蛋白的高滴度重组病毒rvGST53。rvGST53感染Sf9细胞,SDSPAGE和Western印迹分析表明：与GST融合的ORF5基因在Sf9细胞中获得高效表达,表达产物分子量为45kD,能与抗PRRSV E蛋白单克隆抗体发生特异性反应。将表达产物免疫小白鼠,经间接免疫荧光检测,免疫血清能使PRRSV YA株感染的MARC145细胞呈较强的荧光着色,证实表达的融合蛋白具有良好的免疫原性。