耻垢分枝杆菌中一个TetR家族转录因子负调控异烟肼的敏感性

[目的] 研究TetR家族转录因子Ms0606对耻垢分枝杆菌耐药性的调控作用。[方法] 首先,通过测定生长曲线检测Ms0606在分枝杆菌耐药性中的调控作用;通过凝胶迁移阻滞实验和DNase I足迹法鉴定转录因子Ms0606识别的保守序列,进而探究其潜在的靶基因;其次,利用逆转录-qPCR和β-半乳糖苷酶活性实验检测Ms0606对靶基因Ms0608的调控作用,进一步探讨Ms0606调控分枝杆菌耐药性的分子机制。[结果] 与野生型菌株相比,Ms0606超表达菌株对异烟肼表现为敏感,Ms0606敲除菌株对异烟肼表现为抗性;Ms0606可以识别其自身操纵子上游区域内保守的22 bp回文序列,利用回文序列搜索耻垢分枝杆菌的基因组,发现Ms0606可能调控5个潜在靶基因;逆转录-qPCR和β-半乳糖苷酶活性实验显示Ms0606作为抑制子负调控Ms0608的表达,这可能会影响分枝杆菌对药物的耐药性。[结论] 鉴定了一种新的由Ms0606编码的耻垢分枝杆菌的TetR家族转录调控因子,该因子可调节分枝杆菌对异烟肼的敏感性,并进一步探讨其对靶基因的调控功能及对分枝杆菌耐药性的调控机制。     

耻垢分枝杆菌的蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312影响其大环内酯类药物的敏感性

【目的】活性氧类分子是机体有氧代谢的自然产物,可以引起氧化损伤,导致细胞DNA突变、蛋白质失活,是细菌耐药产生的原因之一。蚯蚓血红蛋白家族是能携带氧、可逆地结合氧的一类蛋白,在氧代谢过程中发挥重要作用,与活性氧类分子介导的细菌耐药相关。预测耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白,其功能可能与细菌抗药性有关。【方法】通过生物信息学预测耻垢分枝杆菌MSMEG_3312的结构特征。通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析以及启动子表达测定等方法研究MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌抗药的相关性。【结果】与野生菌株mc2155相比,msmeg_3312敲除菌株表现为抗大环内酯类抗生素,而且回补msmeg_3312部分丧失了这种耐药表型。此外,大环内酯类抗生素的胁迫在统计上显著下调msmeg_3312启动子的表达。另外,对作用于核糖体的其他药物,敲除菌株和野生菌株没有抗药性差异。【结论】生物信息学分析显示MSMEG_3312的氨基酸序列具有典型的蚯蚓血红蛋白保守的HHE结构域,预测其二级结构含有4个α-螺旋组成的典型蚯蚓血红蛋白结构。MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌对大环内酯类抗生素的药物敏感性相关,其可能通过影响药物与核糖体50S亚基的作用来发挥功能。     

构建CRISPR-Cas9介导的耻垢分枝杆菌基因组高效删除系统

【背景】耻垢分枝杆菌具有生长迅速和非致病性的特点,可作为结核分枝杆菌致病机理研究替代菌株和类固醇激素生产的工程菌,但目前耻垢分枝杆菌中缺乏高效率的基因组敲除方法。【目的】基于CRISPR-Cas9介导的定点、高效的DNA切割能力,构建耻垢分枝杆菌染色体DNA片段无痕敲除系统。【方法】构建了包含四环素诱导型启动子驱动的密码子优化的cas9基础载体pCas9101,在双侧同源臂长度约为1 kb条件下选用合适的gRNA表达模块,分别测试了对耻垢分枝杆菌mc2155染色体上的3β-羟基类固醇脱氢酶基因(MSMEG_5228,1 071 bp)和胆固醇降解基因簇(MSMEG_5990-MSMEG_6043,约48kb)敲除效率,使用相同大小的同源臂以经典p2NIL-pGOAL方法进行对照,并计算效率。【结果】使用CRISPR-Cas9方法对耻垢分枝杆菌mc2155的3β-羟基类固醇脱氢酶基因敲除效率为22%,胆固醇降解基因簇敲除效率也达到18%,两者连续敲除效率为4%。但对照p2NIL-pGOAL方法未能获得目标DNA片段敲除的菌株。【结论】本文建立的基于CRISPR-Cas9的耻垢分枝杆菌基因组无痕敲除系统显示出较高的敲除效率,该方法可为耻垢分枝杆菌后续研究提供快速高效的基因组操作方法。     

高致病性2型猪链球菌Ⅳ型样分泌系统virB1-89K基因的敲除及其对毒力的影响

[目的]构建高致病性2型猪链球菌Ⅳ型样分泌系统vir B1-89K基因的敲除株和互补株,研究vir B1-89K基因缺失对细菌毒力的影响.[方法]通过同源重组技术敲除vir B1-89K基因,多重PCR筛选敲除株并测序鉴定.再将virB1-89K基因克隆到穿梭质粒pSET1后转入vir B1-89K敲除株中,构建互补株.比较野生株05ZYH33、突变株△virB1-89K和互补株CvirB1-89K三者基本生物学特性的差异,小鼠实验分析virB1-89K基因敲除后对细菌毒力的影响.[结果]成功构建突变株△vir B1-89K和互补株CvirB1-89K,在基本生物学性状无明显改变的情况下,敲除株的毒性降低到野生株的30％,互补株可恢复其毒性.[结论]virB1-89K基因作为2型猪链球菌高致病性菌株05ZYH33的Ⅳ样分泌系统的重要组分,与其高致病性密切相关.     

利用无传染性耻垢分枝杆菌建立小鼠结核病模型的探索

目的:利用耻垢分枝杆菌(M.smegmatismc2155)建立C57BL/6小鼠结核病模型。方法:每天以高剂量(5×107CFU)耻垢分枝杆菌给C57BL/6小鼠腹腔注射,连续感染4周,检测耻垢分枝杆菌对小鼠的致病性。分别于2周和4周处死小鼠,无菌条件下解剖小鼠取肺、脾脏组织匀浆,进行组织内细菌活力检测;通过嗜酸性染色进行分枝杆菌的鉴定;同时进行病理切片的制备,观察肺和脾脏组织的病理变化;最后进行菌体DNA的提取和基因检测,根据上述指标确定小鼠结核病模型的建立是否成功。结果:腹腔感染小鼠2周后,模型组小鼠只有脾脏组织匀浆液出现抗酸染色阳性菌落,肺部组织未见阳性菌落。腹腔感染小鼠4周后,模型组小鼠肺、脾脏组织匀浆液中均可见大量抗酸染色阳性的菌落;组织病理学观察结果显示:小鼠肺组织主要表现为以中性粒细胞为主的炎性病变;基因检测结果表明:模型组小鼠肺组织匀浆液中可检测到耻垢分枝杆菌特异性3-磷酸甘油醛脱氢酶(gap)基因,而脾脏组织未扩增出耻垢分枝杆菌特异性基因。结论:通过腹腔注射无致病性耻垢分枝杆菌方法,成功建立C57BL/6小鼠结核病发生模型,为结核分枝杆菌与宿主相互作用研究提供安全的疾病模型。     

分枝杆菌glpX基因的功能

【目的】构建耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)glpX基因敲除株,研究其在生理代谢中的功能。【方法】利用分枝杆菌噬菌体Che9c重组系统构建耻垢分枝杆菌glpX基因敲除株;比较野生株及突变株在不同碳源培养条件下的生长差异;通过荧光实时定量PCR,比较野生株在以葡萄糖或油酸为唯一碳源培养下,glpX基因的表达水平。【结果】glpX突变株在以甘油或油酸为唯一碳源的培养基中无法生长;野生株在以油酸为唯一碳源培养下,glpX基因表达上调。【结论】glpX基因编码了分枝杆菌糖异生途径必需的和非冗余的果糖1,6-二磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase,FBPase)。     

OxyR介导的细菌氧化胁迫应答调控机制研究进展

OxyR属于LysR型转录因子家族的氧化胁迫调控蛋白,是细菌抵抗氧化胁迫压力的重要调控因子。OxyR能够通过调控过氧化氢酶和过氧化物酶等抗氧化基因的表达清除H₂O₂、参与铁代谢控制胞内过氧化物的产生以及修复生物大分子氧化损伤,从而抵抗氧化胁迫。OxyR的基因表达调控功能依赖于其还原态和氧化态之间的转变,改变调控蛋白对下游基因调控区的亲和能力。氧化态OxyR识别启动子区的结合序列,激活或抑制过氧化氢酶等基因的表达。还原态和氧化态的转换依赖于在氧化状态下分子间二硫键的形成。本文综述了近年来细菌OxyR调控基因表达的最新研究进展,有助于深入理解OxyR在细菌抵抗氧化胁迫的作用方式,为相关致病菌的防治奠定分子基础。     

分枝杆菌glpX基因的功能

摘要:【目的】构建耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)glpX基因敲除株,研究其在生理代谢中的功能。【方法】利用分枝杆菌噬菌体Che9c重组系统构建耻垢分枝杆菌glpX 基因敲除株;比较野生株及突变株在不同碳源培养条件下的生长差异;通过荧光实时定量PCR,比较野生株在以葡萄糖或油酸为唯一碳源培养下,glpX基因的表达水平。【结果】glpX突变株在以甘油或油酸为唯一碳源的培养基中无法生长;野生株在以油酸为唯一碳源培养下,glpX基因表达上调。【结论】glpX基因编码了分枝杆菌糖异生途径必需的和非冗余的果糖1,6-二磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase,FBPase)。     

水稻细菌性条斑病菌中受DSF 调控的鞭毛基因flgD、flgE 的功能分析

[目的]为了阐明可扩散性信号分子(diffusible signal factor,DSF)调控的鞭毛基因对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)Rs105的致病性等方面的影响.[方法]采用PCR的方法克隆靶标基因flgDxoc和flgExoc,用同源重组法构建缺失突变体,测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病性及过敏性反应等表型,用反转录PCR(RT-PCR)的方法验证Rs105和ArpfFxoc(rpfFxoc基因的缺失突变体,不产生DSF)中flgDxoc、、flgExoc表达量的差异.[结果]从Rs105基因组中克隆到flgDxoc、flgExoc基因,并证实这两个基因在基因组中均为单拷贝.PCR和Southern杂交结果显示,flgDxoc、flgExoc基因被成功敲除.与野生型相比,突变体的鞭毛产生能力丧失,游动性和趋化性能力减弱,接种水稻叶片显示其致病性部分减弱,基因互补可使其恢复.生长能力和对烟草叶片的致敏性无明显改变.RT-PCR结果显示,flgDxoc、flgExoc基因在△rpfFxoc中的转录水平明显降低.[结论]本试验表明:FlgD、FlgE是水稻细菌性条斑病菌鞭毛形成所必需的因子;进一步证明了DSF通过调控flgDxoc、flgExoc基因表达,从而影响条斑病菌的致病性等表型.为深入认识DSF对细菌性条斑病菌鞭毛基因簇的调控提供了科学依据.     

结核分枝杆菌EF4敲除菌株的构建

EF4是一个由 lepA 基因编码的与蛋白质翻译密切相关的延伸因子,在细菌中高度保守,但其确切功能和分子机制尚不清楚,在结核分枝杆菌中的功能至今未见报道。为探索EF4在结核分枝杆菌中的功能,需构建一株结核分枝杆菌 lepA 基因敲除株。本研究以结核分枝杆菌H37Ra全基因组DNA为模板,设计并通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增 lepA 基因左、右臂,连接到p0004S质粒,构建同源重组质粒p0004S-Δ lepA 。然后,通过噬菌体体外包装,将p0004S-Δ lepA 质粒连接到phAE159质粒,构建phAE159-Δ lepA 噬菌体包装质粒。在耻垢分枝杆菌mc 2155中大量扩增噬菌体并受结核分枝杆菌侵染进行同源重组,筛选阳性克隆,从基因组和蛋白质表达水平检测该突变株中 lepA 基因及EF4蛋白表达。PCR结果显示,敲除株基因组中 lepA 基因已被潮霉素抗性基因成功替换,蛋白免疫印迹结果显示该敲除株中无EF4表达,表明其为成功构建的Ra Δ lepA 。生长曲线分析显示,正常培养条件下,结核分枝杆菌野生株与敲除株生长趋势一致。敲除株与野生株在菌落形态上有一定差异,相比于野生株,Ra Δ lepA 菌落颜色发黄,凸起偏厚,生长过程中生物膜皱褶较少。耐胁迫能力分析显示,与野生株相比,Ra Δ lepA 耐热、抗去垢剂、抗氧化能力无显著差异,但耐酸性环境能力明显增强。本研究利用噬菌体介导的重组法成功构建了结核分枝杆菌 lepA 基因敲除株,为后续研究结核分枝杆菌EF4的功能提供了重要基础。