采用随机引物组合对绞股蓝作RAPD分析及SCAR鉴定

为寻找简单、可重复的分子鉴定方法,对绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum（Thunb．）Makino）新鲜品、药材干品及其混淆品乌蔹莓（Cayratia japonica（Thunb．）Gagnep）进行了鉴定。首先从2000余条10碱基的随机引物中筛选出20条,并以5条为1组随机分成4组,然后采用RAPD方法对7份不同来源的绞股蓝新鲜品进行扩增,对扩增得到的绞股蓝特征条带进行基因克隆、测序,分析序列特征,再设计特异性引物,最后．用绞股蓝新鲜品、药材干品及其混淆品乌蔹莓等样品进行PCR验证。结果显示：RAPD扩增能够得到7份绞股蓝新鲜品重复的共有特征条带;经基因克隆、测序并设计特异性引物后进行PCR验证,获得了绞股蓝特异序列扩增区域标志（Sequence—characterized amplified region maker,SCAR）。初步建立了区分绞股蓝及其混淆品乌蔹莓的分子鉴定标准,并首次将SCAR应用于绞股蓝分子鉴定中。     

盐藻RAPD反应条件的优化

从盐藻中提取基因组DNA作为模板进行RAPD反应的优化试验 ,获得PCR扩增反应的最佳条件 :随机引物为CPS32 0 (5′ GGCTCATGTG 3′) ;2 0 μl体系中Mg2 2 .0mmol/L ,退火温度 35℃ ;Taq酶活性值 0 .8U。     

濒危植物七子花RAPD条件的优化

以改进SDS法抽提濒危植物七子花嫩叶总DNA,进行随机扩增多态DNA（RAPD）分析,分别测试了镁离子, dNTP,模板DNA含量,引物和DNA聚合酶量对反应结果的影响,通过各因子的组合研究,可知七子花RAPD分析较适宜的扩增条件是：15 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液（10 mmol/L Tris·HCl pH 9.0, 50 mmol/L KCl, 0.1% Triton X_100）,2.5 mmol/L MgCl2,2U Taq酶（上海华美公司）,10 ng模板DNA,20 pmol引物（上海Sangon公司）;dATP、dCTP 、dGTP 、dTTP 各0.1 mmol/L。     

8份广西产绞股蓝种质的RAPD引物筛选及其遗传多样性分析

本研究的目的在于筛选合适的RAPD随机引物,应用RAPD技术对药用植物绞股蓝进行遗传多样性分析,并构建DNA指纹图谱。研究结果表明,我们利用生物信息学方法挑选出的20条引物中有19条引物的扩增条带清晰且多态性好;在清晰稳定出现的354条带中,294条具有多态性;其中有3条引物的扩增条带可清楚区分绞股蓝与混淆品种乌蔹莓,可建立其DNA指纹图谱。按UPGMA法进行聚类分析,计算其遗传相似系数,结果显示,8份绞股蓝供试材料聚为两类,聚类结果与其地理区域远近和生长环境一致。本研究中筛选出的19条引物适用于绞股蓝遗传多样性分析,且获得的DNA指纹图谱可用于鉴别绞股蓝。     

曼地亚红豆杉RAPD反应体系与程序的优化

以曼地亚红豆杉为研究对象,采用L16(45)正交组合实验和单因素梯度实验对MgCl2、dNTP、随机引物、Taq酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等影响RAPD扩增的重要因素进行优化,以期建立最优的RAPD反应体系与程序。实验结果表明,各因素最适条件为:25μLPCR反应体系中10×Buffer2.5μL,MgCl21.5mmol/L,dNTP0.2mmol/L,随机引物0.6μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA80ng;退火温度为37℃,循环次数为45次。     

怀地黄ISSR扩增条件优化的研究

用CTAB法提取怀地黄嫩叶DNA,进行简单重复间序列标记(ISSR)分析.通过单因子实验分别研究了退火温度、Taq酶单位、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,找出各自的合适条件,而且每一个合适条件确定以后都被作为后续研究的一个条件.通过各个因子的组合研究建立了适宜于怀地黄ISSR分析的扩增体系25 μL PCR反应体积,1×Taq DNA酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,0.1% Trion X-100,pH9.0 ),2.5 mmol/L MgCl2,1.5～1.0 U Taq酶,60 ng模板DNA,0.4 μmmol/L引物,各0.4 mmol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP.合适的退火温度为53～55℃.为用ISSR技术分析鉴定怀地黄种质资源奠定了良好的基础.     

红锥基因组RAPD反应体系的建立和优化

以红锥(Castanopsis hystrix A.DC.)嫩叶为材料,应用改良的CTAB方法成功提取了红锥基因组DNA,并对影响随机扩增多态DNA(RAPD)反应的各因素进行了优化,建立了红锥RAPD的优化反应体系及程序.在25μl反应体系中,模板DNA 0.8 ng μl-1,10×Buffer 2.5 μl,Mg2 2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.8 U,dNTPs 0.35 mmol/L,随机引物S42 0.28 μmol/L.PCR循环程序为:94℃预变性3 min,然后94℃ 30 s,39℃ 1 min,72℃ 2 min,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存.     

红曲菌基因组DNA提取及RAPD反应体系优化

为了建立一套适合红曲属真菌RAPD反应的优化体系,用改进的CTAB法提取红曲菌基因组DNA,采用单因素试验探讨RAPD反应体系中模板DNA、随机引物、Taq酶、Mg^2＋、dNTPs对扩增结果的影响。结果在20μL体积中,模板DNA20 ng、随机引物0、2μmol/L、Taq酶、Mg^2＋1.5mmol/L,dNTPs 1mmol/L的反应体系可得到稳定清晰的RAPD扩增图谱,为采用RAPD技术进行红曲菌种质资源遗传多样性研究奠定基础。     

缢蛏SRAP-PCR体系的正交优化

运用L16(45)正交设计对影响缢蛏SRAP-PCR反应的5个因素:Taq酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、dNTPs浓度和引物浓度在4个水平上进行了优化试验,PCR结果采用SPSS v16.0软件分析.结果表明,各因素对SRAP-PCR反应的影响依次为:引物>Taq酶>模板DNA>Mg2+;缢蛏SRAP反应最佳体系为:在20μL PCR反应体系中,引物0.3 μmol/L、Taq 酶0.5 U、模板DNA 50 ng、dNTPs 0.2 mmol/L及Mg2+2 mmol/L.用不同缢蛏的基因组DNA两次SRAP-PCR扩增,8对引物均能扩增出清晰且重复性好的谱带.因而建立的缢蛏反应体系稳定可靠.     

胡麻专化型尖孢镰刀菌ISSR-PCR最佳反应体系的建立

采用正交试验设计原理,对尖孢镰刀菌ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素进行优化筛选,确立了适合尖孢镰刀菌ISSR分析的反应体系,即25μL PCR反应体积中合有20 ng模板DNA、1 U Taq酶、0.4 μmol/L引物、0.2 mmol/LdNTPs、4.0 mmol/L Mg2+和2.5 μL 10 × buffer.PCR反应最佳退火温度根据引物而定,在此基础上筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.此研究为今后利用ISSR技术分析尖孢镰刀菌遗传多样性和群体结构奠定了基础.