萝卜抗真菌蛋白1（Rs—AFP1）在大肠杆菌中的融合表达及其对大丽轮 …

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）获得了萝卜（Ｒａｑｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）抗真菌蛋白１（Ｒｓ－ＡＦＰ１）基因编码区核苷酸序列。将整个阅读框架片段和云除了Ｎ－端信号肽序列的片段分别装入原核表达载体ｐＥＴ－３２ｇ（＋）中,在大肠杆菌中表达,发现带有信号 的Ｒｓ－ＡＦＰ１不能在大肠杆菌中表达,而当这一序列去除后,表达出约２７ｋＤ的Ｒｓ－ＡＦＰ１的融合蛋白。用凝血酶处理融合蛋白以云除Ｎ－端Ｈｉｓ．ｔ     

人睫状神经营养因子突变体基因克隆及高效表达

为了提高人睫状神经营养因子（ＣＮＴＦ）的生物学活性,用ＰＣＲ方法获取Ｎ端缺失１４个氨基酸的ＣＮＴＦ基因片段,经酶切鉴定、核酸测序证实突变体的核苷酸序列,将其重组至表达质粒ｐＢＶ２２０,构建了ＣＮＴＦ突变体表达载体ｐＢＶ－ＣＮＴＦΔ．用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其表达水平,鸡胚背根节无血清培养法检测表达蛋白的生物学活性．结果表明,ｐＢＶ－ＣＮＴＦΔ能表达生物学活性高于天然ＣＮＴＦ的约２６ｋＤ蛋白质,表达水平达３０％．为今后通过基因工程方法获得ＣＮＴＦ突变体,从而制备高效的ＣＮＴＦ制剂创造了条件．     

人骨形成蛋白2A活性片段在大肠杆菌中的高效表达

将编码人骨形成蛋白２Ａ（ＢＭＰ２Ａ）Ｃ端１７３个氨基酸（ＢＭＰ２３）和１３４个氨基酸（ＢＭＰ２４）的ＤＮＡ基因片段分别重组克隆进入ＰＬ启动子控制下的表达载体,构建了表达质粒ｐＢＬＢＭＰ２３和ｐＢＬＢＭＰ２４,分别转化大肠杆菌进行表达研究．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析温敏诱导的表达菌,可以分别观察到分子量为２０ｋＤ和１５．５ｋＤ的高表达条带,与理论计算的分子量一致,表达量分别占细菌蛋白质总量的１０％和２０％左右。表达产物经包含体制备达到８０％以上纯度。Ｎ端序列测定的１５个氨基酸,与重组ｃＤＮＡ基因编码的序列相同．ＢＭＰ２３和ＢＭＰ２４包含体经复性处理后,得到二聚体分子蛋白质条带,与骨基质胶原重组后在大鼠体内测活,观察到ＢＭＰ２３诱导软骨细胞生成,ＢＭＰ２４刺激丰富的骨样胶原组织合成．     

新城疫病毒融合蛋白基因部分序列分析

Ｆ蛋白是ＮＤＶ中具有抗原性的两种表面糖蛋白之一,通过ＲＴ－ＰＣＲ,克隆了速发现ＮＤＶ中国株Ｆ４８Ｅ８的Ｆ基因,比较分析Ｆ４８Ｅ８,ＡＵＳ和ＩＴＡ等速发型株系Ｆ基因的Ｎ端结构,氨基酸同源性分别达９５％和９３．６％,变化主要集中于信号肽区,成熟蛋白质的同源性极高。该基因的克隆为研制ＮＤＶ的基因工程疫苗打下基础。     

水稻几丁质酶基因克隆RCH8的DNA结构分析

用ＤＮＡ外切核酸酶Ⅲ和Ｓ１核酸酶生成连缺失突变体,用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法对该克隆进行双向ＤＮＡ顺序测定,测序全长２０４９个碱基,初步确定了１０５７ｂｐ的５‘端上游顺序,９６６ｂｐ不含内含子的完整编码区和可能的ＴＡＴＡｂｏｘ等。所编码的３２２个氨基酸包括Ｎ－端２０个氨基酸的信号肽,其后４０个氨基酸长度的含８个半胱氨的ｈｅｖｅｉｎｘ结构域和一个催化结构域。     

传染性法氏囊病病毒中国强毒株A节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ） 强毒株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株,Ｈ） 的基因组ＲＮＡ为模板,用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ） 的方法得到了其Ａ 节段的全长ｃＤＮＡ 片段,分５＇端（１ ６５９ｂｐ） 和３＇端（１ ４４４ｂｐ） 上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ○Ｒ － Ｔ 载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为３ １０１ ｂｐ 中含有两个阅读框ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ ,分别编码１ ０１２ 个氨基酸的前体蛋白（ＶＰ２ － ４ －３） 和１４５ 个氨基酸的ＶＰ５,ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的ＩＢＤＶ 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较,结果表明：Ｈ 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间,在核苷酸水平上存在２５ｂｐ － ２６７ｂｐ 的差异;在氨基酸水平上存在１７ ～４０ 个氨基酸的差异。在ＶＰ２ － ４ － ３ 内比较显示,Ｈ 毒株与Ｐ２ 、Ｃｕ－ １ 之间氨基酸的差异最小为１ ．７％ ,Ｈ 毒株与ＵＫ６６１ 之间氨基酸的差异最大为３ ．９ ％ 。变异主要发生在ＶＰ２ 的可变区（２０６ － ３５０ 位氨基酸） ,在Ｈ 毒株所特有的１２ 个氨基酸当中,该区就占５ 个,代表１ ．７６ ％ 的变异。ＶＰ４、ＶＰ３ 和ＶＰ５区各有     

表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免？…

将将城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株融合蛋白基因导入鸡痘病毒（ＦＰＶ）插入载体ｐＥＧＦ１１７５－１的Ｐ７．５启动子下游,得到转移载体ｐＦＧ１１７５－１重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染ＦＰＶ２８２Ｅ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）。,经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒ｒＦＰＶ－ＮＤＦ。间接免疫荧光试验表明,ｒＦＰＶ－ＮＤＦ感染的ＣＥＦ中表达了ＮＤＶ的融合蛋白。用ｒＦＰＶ－ＮＤＦ免疫的ＳＦ     

美洲商陆一种抗真菌蛋白的cDNA克隆及序列分析

根据美洲商陆种子中一种抗真菌蛋白ＰＡＦＰ的Ｎ端部分氨基酸顺序,设计,合成一条５‘端寡核苷酸引物,通过３’－ＲＡＣＥ技术从种子总ＲＮＡ扩增出一约３５０ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,成功地克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统中。序列分析该,ｃＤＮＡ含有１１４ｂｐ的编码区,由此推导的３８个氨基酸序列有３６个与ＰＡＦＰ的序列相同,仅在第３５,３６位氨基酸分别由Ｃｙｓ,Ｌｙｓ代了后者的Ｇｌｎ和Ｉｌｅ。     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

粘虫核型多角体病毒一个新基因的序列和结构研究

本文报道ＴｓＮＰＶＤＮＡＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ的５．５ｋｂ片段的克隆及其物理图谱。测定了其中一个８１９ｂＰ片段的全序列。在长３４６ｂｐ的完整ＯＲＦ的５’端除有ＴＡＴＡｂｏｘ和ＣＡＡＴｂｏｘ以外,还发现有典型的早期基因启动子元件ＡＣＧＴ和ＧＣ单元以及晚期基因的转录起始保守序列ＴＴＡＡＧ。预测的ＯＲＦ产物为１１４个氨基酸、分子量为１３ｋＤ的蛋白质,故命名为ｐ１３蛋白。在ｐ１３基因的Ｃ端和Ｎ端分别有一个亮氨酸拉链和两个类亮氨酸拉链结构（我们称为亮氨酸转型结构和ＬＶＴ重复结构〕．从终止密码起有一个双发卡环结构,ｐ１３基因的５’端调控单元及其排列与ＢｍＮＰＶ和ＡｃＮＰＶ的细胞序死抑制基因（ｐ３５）十分相似,但ｐ１３基因与已经发现的杆状病毒基因序列和氨基酸序列没有同源性．因此,这是一个新的早晚期基因,其调控元件可能具有重要功能。     

耐热碱性磷酸酶功能结构域的进一步定位

为了进一步精确定位耐热碱性磷酸酶 (TAP)的功能结构域和建立酶功能结构域定位的有效方法 ,在对TAP进行序列相容性比对及二级结构统计预测的基础上 ,以二级结构单元的完整性为依据对其功能结构域进行定位 .TAP的功能结构域在 35～ 4 76氨基酸之间 ,记为TAPN3 4C2 5(TAP的N端去掉 34个氨基酸而C端去掉 2 5个氨基酸 ) ,比盛小禹等定位的少 15个氨基酸 .克隆、表达实验结果证明了TAPN3 4C2 5的酶学活性 ,其最适反应温度为 72℃ ,比TAPND2 7(N端去除了 2 7个信号肽氨基酸的TAP)上升了 7℃ ,而最高耐受温度为 83℃ ,比TAPND2 7下降了 16℃ .实验结果表明 ,以二级结构预测结果进行酶功能结构域定位是一种更为精确的方法 .     

耐热碱性磷酸酯酶的功能结构域的定位

 为了确定耐热碱性磷酸酯酶 (TAPND2 7)发挥活性所必需的功能结构域 ,通过 PCR介导的诱变缺失 ,得到了 N端分别缺失 8、1 6、2 5个氨基酸的 3个缺失体 p TAPN8、p TAPN1 6和p TAPN2 5以及 C端分别缺失 1 0和 30个氨基酸的两个缺失体 p TAPC1 0和 p TAPC30 .经表达和活性测定 ,发现 p TAPN8和 TAPC1 0保持了较高的活性而其余 3个缺失体则失去酶活性 .据此 ,TAPND2 7的活性区域被定位在 8～ 465氨基酸之间 .在分离纯化的基础上测定了一些酶学性质 .发现 TAPN8和 TAPC1 0的比活没有大的改变 ,Tm 下降了 5.5℃ ;TAPN8的最适反应温度上升了1 0℃ .结果提示了 N端和 C端的这些氨基酸残基对热稳定性有一定的贡献 ,N端氨基酸残基还对酶的亲热性有贡献 .     

耐热碱性磷酸酶(FD-TAP)的结构模型研究

 以大肠杆菌碱性磷酸酶 (BAP)为主要结构模板 ,用计算机同源结构模拟方法构建了耐热碱性磷酸酶 (FD TAP)的三维结构 ,对它们的结构特征进行了分析比较 ,并用Profile 3D和Ramachand ran图等方法分析了结构的合理性 .在此基础上 ,又构建了FD TAP 3个突变体的结构 ,用CHARMM能量计算法研究了FD TAP及其 3个突变体的能量与酶蛋白热稳定性之间的关系 ,得到了与实验完全一致的结果 .结果说明 ,如果氨基酸残基置换使蛋白质分子的总能量降低 ,疏水性增高和柔韧性减小 ,往往使蛋白质的耐热性增加     

无机磷酸盐对耐热碱性磷酸酶耐热性的影响

 为研究体外磷酸根离子对嗜热菌 (Thermussp .30 4 1)碱性磷酸酶TAPND2 7耐热性的影响 ,通过克隆于高表达质粒上编码TAPND2 7的基因在E .coli中的诱导表达和蛋白产物的纯化 ,获得了电泳纯的TAPND2 7.耐热性实验表明磷酸根离子能显著提高该酶的热稳定性 ,在 10mmol L磷酸根离子存在下 ,TAPND2 7的Tm 值从 91℃上升到了 97℃ ;酶的动力学实验证实无机磷酸盐 (Pi)对TAP ND2 7的酶活性有可逆竞争性抑制作用 ,Ki 值为 0 99× 10 -4 mol L .上述结果说明 ,TAPND2 7耐热性的提高是由于磷酸根离子对TAPND2 7活性位点的竞争性结合 ,这种结合 ,推测为Pi 与氨基酸残基间的非共价相互作用 ,减小了TAPND2 7的自由能 ,从而提高了它的热稳定性     

同义密码子用语的位置依赖

研究了在大肠杆菌编码区不同位置上的同底密码子用语,发现许多氨基酸的密码子用语在转译起始区有显著的变化,仅有少数氨基酸在转译区有较弱的变化,由于密码子用语与基因表达关系密切。这些结果与实验发现的编码区5‘端密码子用对表达的重要性是一致的。更进一步的结果还暗示了哪些密码子在特定位置的使用可能会影响基因表达。     

cDNA structure of murine C4b-binding protein, a regulatory component of the serum complement system

A cDNA library representing total poly(A+) RNA from the livers of male B10.WR mice was screened with a 1097 base pair (bp) probe obtained from a partial human C4b-binding protein (C4BP) cDNA clone. Two cDNA clones were isolated, the largest of which was sequenced and found to be 1889 bp in length exclusive of the poly(A) tail. The predicted mouse C4BP polypeptide chain encoded by 1239 bp is 413 amino acid residues in length and has a calculated molecular weight of 45,281. The 370-nucleotide sequence upstream from the codon for the predicted amino terminus contains two possible in-phase translational start signals which yield leader sequences of 56 and 13 amino acid residues, respectively. The 3'-untranslated region is 277 bp long, and there are two potential overlapping poly(A) recognition signals, AATTAA and ATTAAAA, located 26 and 25 bp, respectively, upstream from the poly(A) tail; these are preceded by five other potential polyadenylation signals. Beginning at the amino terminus and continuing through to residue 358, there are six contiguous regions of internal homology, each about 60 amino acids in length. The carboxy-terminal 55 amino acid sequence shares no homology with the repeating units. Extensive homology was found with human C4BP at the amino acid level (61%) as well as at the nucleotide level for both the coding and 3'-untranslated regions. Significant differences, however, were observed between mouse and human C4BP.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

Cloning and sequence analysis of the Erythrina corallodendron lectin cDNA.

Examination of the hemagglutinating activity of extracts from seeds of Erythrina corallodendron at various maturation stages revealed that the level of lectin increases markedly past mid-maturation. Seeds at this stage of maturation served as a source of mRNA for the construction of an expression cDNA library in the vector lambda Zap, which generates fusion proteins with an N-terminal portion of beta-galactosidase. The library was screened with rabbit polyclonal anti-ECorL antiserum. Four immunopositive clones were isolated. Western blot analysis of cell extracts from one of the clones (pIEcL-B) showed a 36 kDa protein that reacted with the antiserum, as well as with a mouse monoclonal antibody raised against the lectin. DNA sequence analysis by the chain termination method revealed that clone pIEcl-C has an insert of 1017 bp with the entire coding sequence of ECorL, beginning with an initiation codon ATG at position 26 and ending with stop codon TAA at position 868. This fragment encodes a polypeptide of 281 amino acids consisting of a signal leader sequence of 25 amino acids and a mature protein of 256 amino acids. The deduced amino acid sequence from this fragment is identical to the sequence of the first 244 amino acids of ECorL, as determined at the protein level, except at 7 positions.     

A bifunctional xylanase encoded by the xynA gene of the rumen cellulolytic bacterium Ruminococcus flavefaciens 17 comprises two dissimilar domains linked by an asparagine/glutamine-rich sequence

The nucleotide sequence of the xynA gene of Ruminococcus flavefaciens 17 was determined and found to consist of a 2862bp open reading frame beginning with a TTG start codon. The predicted product, XYLA, consisted of distinct amino-terminal (A) and carboxy terminal (C) domains (248 amino acids, including a putative signal sequence, and 332 amino acids, respectively) linked by a repetitive sequence (B, 374 amino acids) extraordinarily rich in asparagine (45%) and glutamine (26%) residues. Domains A and C were shown to be capable of expressing xylanase activity independently of each other when suitably truncated derivatives of the xynA coding region were expressed as lacZ fusions. The activities associated with the two domains were shown to differ with respect to the average size of hydrolysis products formed from oat-spelt xylan, with domain C releasing relatively more xylose and domain A more xylo-oligosaccharides. The amino acid sequence of domain A of XYLA closely resembled that of the Bacillus pumilus xynA enzyme (45% identical residues). On the other hand domain C showed significant similarity (33% to 40% identical residues) to a different group of bacterial xylanases and exoglucanases exemplified by the Caldocellum saccharolyticum xynA and celB products. The xynA product is, therefore, a bifunctional enzyme having two dissimilar catalytic domains capable of acting on xylan.     

RNA editing in ATPase subunit 6 mRNAs in Oenothera mitochondria. A new termination codon shortens the reading frame by 35 amino acids.

The open reading frame encoding ATPase subunit 6 in Oenothera mitochondria is edited at 21 positions in all cDNA clones investigated. Only one of these events is silent, all others improve similarity between the homologous polypeptides of other species. The introduction of a new UAA termination codon shortens the polypeptide by 35 amino acids to a carboxy terminus conserved in other species. In one of the cDNA clones, an additional editing event was observed resulting in a premature UAA termination codon in the amino terminal region.