双价抗虫基因叶绿体共转化植株抗虫性及其后代表型分析

利用基因枪法将含有水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC)基因烟草叶绿体表达载体和含有苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因(Bt cry IAc)烟草叶绿体表达载体,共转化烟草叶绿体,获得壮观霉素抗性植株。转基因植株抗棉铃虫试验表明,转双价抗虫基因植株比转单一抗虫基因植株具有更强的杀虫活性。转基因植株后代Southern检测及其遗传学分析试验证明,双价抗虫基因可以稳定地遗传给后代,且表现为叶绿体特有的母系遗传规律。 Abstract:The Bt gene and OC gene were cotransformed to tobacco chloroplast with particle bombardment method and spectinomycin resistance tobacco seedlings were obtained.Bioassays showed that the transgenic tobacco containing both genes had enhanced toxicity to the larvae of cotton bollworm (helicoverpa zea) by comparison with the plants containing only Bt or OC gene.Southern-blotting analysis and genetic analysis of progenies showed that the Bt and OC gene expressed and was inherited maternally to the progenies.     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法。通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm。载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA。利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59．2％。对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19．5％的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ。这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物。研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20．0％～47．4％,低于使用双T-DNA转化的共转化频率。     

导入蜘蛛杀虫肽基因的烟草具有抗虫性

用带有杀虫肽基因的农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４ 转化烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ）叶片,共获得３０ 株抗卡那霉素的再生植株． 用这些再生植株对棉铃虫（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍ ｉｇｅｒａ）进行毒力测定,有３ 株转杀虫肽基因植株对棉铃虫有较强抗性． 与对照相比,这３ 株转基因烟草的杀虫率可达３０％～４５％ ,并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育,表现出明显的抗虫作用． 以这３ 株为主进行了ＰＣＲ 扩增及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ实验,结果表明杀虫肽基因已插入到这３ 株植株的基因组中并表达出有活性的杀虫肽     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法.通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm.载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA.利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59.2%.对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19.5%的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ.这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物.研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与 bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20.0%～47.4%,低于使用双T-DNA转化的共转化频率.     

人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究

根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因sNK和其中插入番茄果实特异表达基因E8第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i,通过农杆菌侵染的方法转化到烟草NC89中。经PCR检测,得到12株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株,初步证明目的基因已整合到烟草基因组中;RT-PCR检测有9株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株为阳性;通过RT-qPCR将两种基因在烟草中的表达量进行比较,结果表明转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因的植株中高;通过纤维蛋白平板法检测其活性,共有5株转sNK基因烟草植株和3株转sNK-E8i基因烟草植株检测到溶圈,说明目的基因在部分转基因烟草中可正常转录和翻译并表现出溶栓活性。经加代培养已得到T1代转基因植株。     

棉花乙烯合成基因促进拟南芥和烟草不定根发生的研究

从棉花纤维cDNA中克隆获得乙烯合成基因GhACO3,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO3.通过花序侵染法和叶盘法分别转化拟南芥和烟草,利用卡那霉素筛选及分子检测获得转基因阳性拟南芥和烟草植株.结果表明,GhACO3基因已整合到拟南芥和烟草基因组中;经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株;与野生型拟南芥相比,GhACO3基因对拟南芥不定根发生具有显著促进作用;与野生型烟草植株相比,转GhACO3基因烟草不定根发生得到了显著的促进.研究表明,GhACO3基因的过量表达能够促进拟南芥和烟草不定根的形成发育,为进一步探讨GhACO3的生物学功能和进行转基因育种奠定了基础.     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

中南民族大学生命科学学院李静、刘学群和王春台3位科研工作者利用从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因（GT—like），通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5’端-1150～0上游调控区，经序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT—Like基因启动子与gus报告基因连接，构建植物表达载体pGT-gus，经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明：     

表达苏云金杆菌5－内毒素基因的转基因烟草的抗虫性

苏云金杆蓠(Bacillus thuringiensis)HD-1的δ-内毒索基因原始克隆THl2和TH48分别含有5．3kb和6．6kb型类同源异族基因。经定点突变改造其5’端,酶切对3’端进行缺失后,在大肠杆菌中仍能表达出有杀虫活性的被修饰的毒蛋白。将上述加工过的基因插入到双元载体pBin437(pBinl9的派生质粒)中,借助辅助Ti质粒(Pal,1404转人烟草,获得了抗卡那霉索的再生植株。经southern印迹和狭槽印迹(slot blot)杂交证明有1-5个拷贝的毒素基因整合至烟草染色体中。Northern印迹法分析结果表明这两类基医都在转基因植株中得到表达。育4株5．3kb类型,3株6．6kb类型的转基因植株对烟青虫有高抗性,与对照相比,这7株转基因烟草植株的杀虫率可达40一50％,并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育,表现明显的抗虫作用。结果表明这两类毒蛋白基因都可在植物中表达并赋予转基因植株以抗虫性。     

转小拟南芥ApHRD基因烟草获得及其抗旱性鉴定

根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HRD基因序列,采用PCR方法从新疆小拟南芥(A.pumila)中克隆了ApHRD基因,并构建了植物表达载体pBIN-ApHRD,通过农杆菌介导法转化烟草('NC89')获得转化植株,用PCR和RT-PCR法对转化烟草进行鉴定,并采用水分胁迫和PEG-6000模拟干旱进行抗旱性分析.结果显示:(1)克隆的新疆小拟南芥ApHRD基因与拟南芥AtHRD基因的核苷酸序列相似性为99.1%,对应氨基酸序列的同源性为98.37%,只有3个位点发生实义突变.(2)与野生型烟草植株相比,转ApHRD基因烟草植株主根粗壮,一级侧根较发达,移栽成活的植株生长快.(3)在水分胁迫和30%的PEG-6000模拟干旱胁迫条件下,转ApHRD基因烟草的叶片相对含水量和PSⅡ相对量子产率降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均显著低于野生型烟草植株;与野生型植株相比,转ApHRD基因烟草植株叶片出现萎蔫症状的时间较迟、程度较轻,复水后恢复快且较完全,在干旱胁迫过程中受到的伤害较轻,表现出了较强的抗旱特性.研究表明,在干旱胁迫条件下,转小拟南芥ApHRD基因烟草植株表现出了优良的生理和生长优势,显示出较强的抗旱性特征,ApHRD基因在抗旱基因工程方面具有较好的应用前景.     

转双基因烟草对棉铃虫的杀虫活性评价*

以含Bt杀虫蛋白基因(单基因)烟草和常规烟草为对照,系统测定了含Bt与豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)蛋白基因(双基因)的抗虫烟草对棉铃虫(Helicoverpa armigera)不同龄期幼虫的杀虫活性.结果表明：1～3龄幼虫取食转双基因烟草3d后死亡率为80.5%～99.3%,取食6d后死亡率达100%,均显著高于转单基因烟草。2龄幼虫取食转基因烟草3d后转至正常饲料,转双基因烟草对幼虫死亡率、存活虫体重、化蛹率和化蛹时间等生长发育的影响,均显著高于转单基因烟草。