假橐吾内生菌分离及其拮抗菌的筛选与鉴定

从菊科植物假橐吾(Ligulariopsis shichuana Y.L.Chen)中分离得到110株内生真菌和26株内生放线菌,依照形态培养特征对菌株进行初步分类鉴定,采用琼脂块法进行拮抗菌株筛选,并对拮抗性最好的2株内生放线菌进行分子鉴定.结果表明:(1)经初步鉴定,将分离到的假橐吾内生真菌合并为86种,分为10个属,其中交链孢霉属和丝核菌属占优势(分别为41.9%和16.3%);内生放线菌分为3个属,其中链霉菌属占优势(92.3%).(2)抗菌活性试验表明,有31株内生真菌分别对细菌、植物病原真菌具有显著抑制作用,全部内生放线菌对靶标菌有抗性,其中菌株wz57和wz01拮抗性最强.(3)根据16S rDNA序列比对结果,菌株wz57和wz01与链霉菌属(Streptomyces griseoplanus)相似性最高,分别达到99.3%和99.5%,初步归为Streptomyces griseoplanus.     

丹参植株内生菌的分离纯化及其抗病性研究

为探明丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)内生菌的种类,筛选拮抗农作物病害菌的生防菌株,从健康丹参植株中进行内生菌分离,依照形态特征以及16SrDNA序列对菌株进行初步分类鉴定,采用琼脂块法进行拮抗菌株筛选,并选取拮抗活性较强的菌株液体发酵进行体外抑菌试验。结果表明:(1)从丹参植株中共分离得到69株内生菌(真菌62株、放线菌7株),其中23株内生真菌属于无孢类群或现有条件不适合产孢,其余真菌菌株中串珠镰孢菌属(Fusarium moniliforme Sheld.)和交链孢菌属(Alternaria sp)为优势菌群;7株内生放线菌均为链霉菌属。(2)病原菌拮抗性实验表明,有44株内生菌对病原菌具有不同程度的拮抗活性,其中12株内生菌对2种及以上靶标病原菌具有拮抗活性,表明丹参内生菌具有一定的广谱抗菌性。(3)放线菌菌株A232的次级代谢产物对白色假丝酵母(Canidia albicans)和苹果腐烂菌(Valsa mali)都表现出较强的拮抗活性,通过形态、培养特征以及16SrDNA序列分析,鉴定其为Streptomyces luteoverticillatus。     

药用植物青蒿不同种类的内生菌抑菌活性分析

为了研究青蒿不同种类的内生菌抑制细菌和抑制真菌的活性,该研究采用组织块法和研磨法从青蒿的根、茎、叶中分离内生细菌、放线菌和真菌,以大肠埃希菌(Escherichia coli)(CICC 23657)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(CICC 10275)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CICC 10384)、黑曲霉(Aspergillus niger)(CICC 2487)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(CICC 33032)为指示菌,采用琼脂块法和双层平板法检测内生菌的抑菌活性。结果表明:(1)从青蒿植株中共分离到76株内生菌,其中内生细菌19株、内生放线菌34株、内生真菌23株。从分离部位来看,56株来自于茎段、17株来自于根段、3株来自叶片。(2)内生细菌中抑菌活性菌株占总菌株的比例最高,为95%,内生放线菌和内生真菌中抑菌活性菌株的比例分别为41%、35%。(3)内生细菌的抗菌谱较广;虽然内生放线菌的抗菌谱较窄,但其中高抗菌株较多,尤其对酿酒酵母的抑菌效果好。综上结果显示,药用植物青蒿中存在着丰富的有抑菌活性的内生菌,且不同种类的内生菌抑菌活性不同。     

宁前胡内生真菌Fusarium tricinctum固体发酵代谢产物研究

为了解宁前胡内生真菌Fusarium tricinctum固体发酵代谢产物的化学成分,采用硅胶色谱、中压以及制备液相等方法对其进行分离鉴定和抗肿瘤活性研究。结果表明,从其中分离得到14个化合物,结构鉴定分别为fungerin (1)、fusagerins F (2)、6-[(3R)-3-hydroxybutan-2-yl]-5-(hydroxymethyl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (3)、6-[(3S)-3-hydroxybutan-2-yl]-5-(hydroxymethyl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one(4)、6α-chlamydosporol(5)、6β-chlamydosporol(6)、(3R,4R)-(–)-4-hydroxymellein(7)、(3R)-(–)-8-hydroxymellein (8)、enniatin B (9)、enniatin B1 (10)、enniatin A1 (11)、enniatin A (12)、enniatin B3 (13)和enniatin B2 (14)。所有化合物均为首次从宁前胡内生真菌中分离得到。体外抗肿瘤活性试验表明化合物均无显著的细胞毒活性。     

南方红豆杉内生及根际放线菌多样性及其生物活性

【目的】研究药用植物南方红豆杉内生及根际土壤放线菌的多样性及其抑菌、抗肿瘤等重要生物活性并获得一些具有强抑制植物病原真菌以及抗肿瘤等重要生物活性的菌株。【方法】选择7种培养基从南方红豆杉及其根际土壤中分离放线菌,对链霉菌进行形态学分类,去重复后对其进行抑制植物病原真菌以及抗肿瘤活性的筛选并对高活性菌株进行初步鉴定。对部分菌株进行16S rRNA基因测序分析研究其多样性。【结果】研究共分离得到277株放线菌,经去重复后剩余111株放线菌,可归类到6个亚目、7个科、8个属。其中链霉菌可分为10个类群。生物活性研究结果显示:30.9%的菌株具有抑制植物病原真菌活性,其中6株放线菌对多种植物病原真菌显示了强的抑菌活性。分别有44.1%和33.3%的菌株对胃癌肿瘤细胞株SGC-7901和肺癌肿瘤细胞株NCI-H460的抑制率在40%以上。【结论】药用植物南方红豆杉及其根际土壤蕴含种类丰富的放线菌资源,具有良好的生物学活性。菌株KLBMP 2170具有显著的抑菌以及抗肿瘤活性,值得我们去进一步研究。     

川楝内生放线菌多样性及抗菌活性筛选

【目的】探究药用植物川楝内生放线菌多样性,从中挖掘出新的放线菌菌株,发现新的潜在农业生防和医药先导化合物。【方法】从四川境内的资阳、遂宁以及重庆万州采集川楝的根、茎、叶、果、皮,采用纯培养方法,用4种培养基共分离获得148株放线菌。通过形态学观察筛选出60株放线菌进行RFLP分析,选出代表菌株进行16S r RNA基因序列分析。以3株细菌和6株病原真菌作为指示菌株,检测初筛出的60株菌株的抗菌活性以及聚酮合酶(PKSⅠ、PKSⅡ)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因和卤化酶(Halo)基因。【结果】基于16S r RNA-RFLP分析,60株放线菌被分成10簇,筛选出25株代表菌株分别属于7个属,包括Streptomyces、Micromonospora、Planotetraspora、Streptosporangium、Nocardiopsis、Prauseria、Microbispora,其中链霉菌占73.3%。供试的川楝内生放线菌对细菌、真菌有不同程度的抗菌活性;其中含有4类化合物合成基因的菌株占10%-55%。【结论】药用植物川楝内生放线菌具有丰富的多样性,且不同地区不同部位川楝组织中放线菌的种群存在差异;分离菌株广谱的抗菌活性证明,川楝内生放线菌在次生代谢产物合成方面具有巨大潜力,这为进一步的药物开发提供了丰富的菌种资源。     

艾纳香内生真菌粉红粘帚霉抗菌次生代谢产物

植物内生真菌一直是发现结构新颖、活性广泛的化合物的重要宝库。文中对一株艾纳香内生真菌粉红粘帚霉Clonostachysrosea进行化学研究,通过活性跟踪手段,结合硅胶柱色谱、凝胶色谱、以及半制备液相色谱技术从该菌株的发酵提取物中共分离获得6个单体化合物,经波谱学技术结合质谱鉴定其分别为verticillin A (1)、(S)-(+)-fusarinolic acid (2)、8-hydroxyfusaric acid (3)、cerebroside C (4)、3-Maleimide-5-oxime (5)以及bionectriol A(6)。所有化合物进行了体外抗大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌4株细菌的活性评价,其中1、4和6对3株细菌表现出显著的抑菌活性,MIC值2–16μg/mL。研究结果为从黎药植物艾纳香的内生真菌中寻找新型抗生素提供重要参考。     

白苞蒿内生真菌的分离及其抗肿瘤抗菌活性筛选

重视药用植物内生真菌的研究,实现利用内生真菌代替药用植物生产活性物质,具有重要的生态学和经济学意义。白苞蒿(Artemisia lactifloraWall.ex DC.)是一种重要的药用植物,已收载于《中国药典》2010年版一部附录,是中药刘寄奴的基原植物之一,具有清热、解毒、止咳、消炎、活血、散瘀、通经等功效,用于肝、肾疾病的治疗。该研究以白苞蒿的根、茎、叶和花为试验材料进行内生真菌的分离,共分离得到白苞蒿内生真菌54株;以人骨髓白血病细胞系(HL-60)、人乳腺癌细胞系(MCF-7)和人前列腺癌细胞系(PC-3)为细胞模型,采用MTT法对54株白苞蒿内生真菌发酵物粗提物的体外抗肿瘤活性进行筛选,发现对3种肿瘤细胞增殖的抑制率在90%以上的菌株共有5株,占总菌株数的9.3%;以白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌3种病原细菌为靶标菌,采用滤纸片法对54株白苞蒿内生真菌发酵物粗提物的抗菌活性进行筛选。结果表明:所有菌株对白色念珠菌均未表现明显的抑菌活性,而对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌有一定抑菌活性的菌株共有17株,占总菌株数的31.5%,其中有2株对金黄色葡萄球菌表现较强的抑菌活性。     

植物内生真菌抗肿瘤活性菌株的筛选*

从三尖杉、南方红豆杉及香榧中分离到172株植物内生真菌,利用抗肿瘤体外细胞毒筛选模型(MTT法)对其进行活性检测。结果表明,25株内生真菌(占总分离菌株的14.5%)对KB（人口腔上皮癌）或HL-60（人白血病）细胞具有显著的抑制活性。三尖杉、南方红豆杉及香榧内生真菌的抗肿瘤活性菌株占各供测菌株的3.3%, 19.6%和8.6%。其中7个菌株的细胞毒ID50为1,000以上,占总供测菌株的4.1%。抗肿瘤活性菌株主要分布在拟青霉属及头孢霉属中。     

药用植物内生放线菌的分离、筛选及活性菌株YIM 61470鉴定

从云南西双版纳热带雨林多种药用植物中分离到272株内生放线菌,活性筛选表明 146株菌的发酵产物具有抗菌活性,其中94株菌具有拮抗病原细菌活性,127株菌具有抑制病原真菌的功能.分离菌株YIM 61470具有广谱抗菌活性,通过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞化学分类特征和基于16S rRNA基因序列的相似性分析等研究,菌株YIM 61470被鉴定为链霉菌属(Streptomyces)氢化链霉菌(S.llydrogenans)的一个菌株.     

剑叶龙血树内生真菌的分离及体外抑菌活性筛选

为研究剑叶龙血树内生真菌资源多样性,初步探讨和筛选具有抑菌活性的特异性菌株以及进一步开发剑叶龙血树内生真菌的抗菌活性化合物。该文采用植物组织分离法从剑叶龙血树茎和叶中分离内生真菌,对内生真菌进行液体发酵7 d,经乙酸乙酯萃取后制得粗提物,并采用牛津杯扩散法,以10种常见病原菌和5种临床耐药菌为靶标检测其发酵粗提物的抑菌活性,对有较好抑菌活性的内生真菌进行分子鉴定。结果表明:(1)从剑叶龙血树茎、叶中共分离得到345株内生真菌,294株对一种以上指示菌有抑制活性;(2)其中84株内生真菌对5株临床耐药菌均有不同程度的抑制活性,占所分离菌株总数的24.35%,75%的内生真菌对金黄色葡萄球菌有抑制活性。这说明剑叶龙血树中存在多种有抑菌活性的内生真菌,为剑叶龙血树内生菌抗菌活性成分挖掘及新型抗菌药物筛选奠定了基础。     

Antitumour and antimicrobial activities of endophytic streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest

Aims: The aim of this study was to screen antitumour and antimicrobial activities of endophytic actinomycetes isolated from pharmaceutical plants in rainforest in Yunnan province, China. Methods and Results: Antitumour activity was studied by the 3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyltetrazolium bromide assay and antimicrobial activity was determined by agar well diffusion method. The high bioactive endophytic isolates were identified and further investigated for the presence of polyketide synthases (PKS‐I, PKS‐II) and nonribosomal peptide synthetases (NRPS) sequences by specific amplification. The molecular identification confirmed that the 41 isolates showed significant activities were members of the genus Streptomyces. Among them, 31·7% of endophytic streptomycete cultures were cytotoxic against A549 cells, 29·3% against HL‐60 cells, 85·4% against BEL‐7404 cells, 90·2% against P388D1 cells, 65·9% were active against Escherichia coli, 24·4% against Staphylococcus aureus, 31·7% against Staphylococcus epidermidis, 12·2% against Candida albicans and no strain displayed antagonistic activity against Klebsiella pneumoniae. High frequencies of positive PCR amplification were obtained for PKS‐I (34·1%), PKS‐II (63·4%) and NRPS (61·0%) biosynthetic systems. Conclusions: Many endophytic streptomycetes isolated from pharmaceutical plants in rainforest possess remarkable and diverse antitumour and antimicrobial bioactivities. Significance and Impact of the Study: These endophytic streptomycetes are precious resources obtained from rainforests, and they could be a promising source for bioactive agents.     

银杏内生菌的分离及其抑菌活性筛选

从健康的银杏（Ginkgo biloba）茎和叶片中分离内生菌,结果从银杏叶和茎上共分离到内生真菌20株,其中9株来自银杏茎部,11株来自银杏叶部;内生放线菌23株,其中15株来自于银杏茎部,8株来自于银杏叶部;内生细菌15株,其中8株来自于银杏茎部,7株来自于银杏叶部。以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为指示菌,采用双层平板法对内生菌进行抑菌活性筛选,结果表明：20株内生真菌中有12株出现了抑菌活性,有抑菌活性菌株的比例为60.0%;23株内生放线菌中,仅3株出现了抑菌活性,有抑菌活性菌株的比例为13.0%;15株内生细菌中,有4株出现了抑菌活性,有抑菌活性菌株的比例为26.7%。     

具抑菌活性连翘内生真菌的分离与鉴定

【目的】从药用植物连翘内生真菌中筛选抑菌活性菌株, 并对其主要活性成分进行检测分析。【方法】采用常规组织分离法分离内生真菌, 滤纸片法测定其发酵产物对3种指示细菌的抑菌活性。TLC、HPLC和HPLC-MS检测活性菌株代谢产物中连翘苷成分。根据形态学特征和ITS序列分析鉴定目的菌株。【结果】分离得到的24株内生真菌中抑菌圈直径超过10 mm的菌株, 发酵液组有11株(45.8%), 菌丝体组有19株(79.2%), 活性菌株主要集中在果实内生真菌中, 其中G5、G7和G10表现出较强的抑菌活性。从菌株G10的胞内产物中发现活性成分连翘苷, 将其鉴定为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。【结论】连翘内生真菌是天然抗菌活性物质的重要筛选来源。     

The Diversity and Anti-Microbial Activity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plants in Panxi Plateau,China

Traditional Chinese medicinal plants are sources of biologically active compounds, providing raw material for pharmaceutical, cosmetic and fragrance industries. The endophytes of medicinal plants participate in biochemical pathways and produce analogous or novel bioactive compounds. Panxi plateau in South-west Sichuan in China with its unique geographical and climatological characteristics is a habitat of a great variety of medicinal plants. In this study, 560 endophytic actinomycetes were isolated from 26 medicinal plant species in Panxi plateau. 60 isolates were selected for 16S rDNA-RFLP analysis and 14 representative strains were chosen for 16S rDNA sequencing. According to the phylogenetic analysis, seven isolates were Streptomyces sp., while the remainder belonged to genera Micromonospora, Oerskovia, Nonomuraea, Promicromonospora and Rhodococcus. Antimicrobial activity analysis combined with the results of amplifying genes coding for polyketide synthetase (PKS-I, PKS-II) and nonribosomal peptide synthetase (NRPS) showed that endophytic actinomycetes isolated from medicinal plants in Panxi plateau had broad-spectrum antimicrobial activity and potential natural product diversity, which further proved that endophytic actinomycetes are valuable reservoirs of novel bioactive compounds.     

海南粗榧内生真菌抗肿瘤抗菌活性的筛选

对72株海南粗榧(Cephalotaxus hainanensis Li)内生真菌进行了抗肿瘤和抗菌活性筛选。结果显示, 有9株内生真菌至少对一种指示瘤株具有细胞毒活性, 5株内生真菌对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性, 1株内生真菌对辣椒疫霉有抑制作用。这表明海南粗榧内生真菌是寻找有价值的生物活性成分的潜在资源, 其生物活性成分值得进一步研究。     

蜘蛛抱蛋属植物内生细菌的多样性及其抗菌活性筛选

【背景】药用植物中蕴含多样性丰富的内生菌资源,这些微生物产生的多种新型物质在制药领域表现出较好的应用前景。【目的】研究蜘蛛抱蛋属(Aspidistra Ker-Gawl.)植物内生细菌的多样性,探索药用植物内生细菌在药用活性产物方面的开发潜力,以期发现具有抗菌活性的次级代谢产物。【方法】对9种13株新鲜的蜘蛛抱蛋植物进行表面消毒,采用5种分离培养基分离内生细菌;根据菌落形态特征排除重复菌株,并测定其16S rRNA基因序列,构建系统进化树分析内生细菌多样性;将菌株分别用2种培养基发酵,使用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis ATCC 700044)、水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae PXO99A)、白色念珠菌(Candidaalbicans ATCC 10231)、肺炎雷伯菌(Klebsiella pneumoniae ATCC 700603)和耐药粪肠球菌HH22(Enterococcus faecalis HH22)5种检定菌对分离菌株的发酵液进行抑菌活性筛选。【结果】从植物组织中分离得到了234株内生细菌,根据形态初步排重得到156株植物内生细菌;基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树显示它们分属于3门10目22科29属,其中链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和根瘤菌属(Rhizobium)的菌株广泛地分布在不同种的蜘蛛抱蛋植株中,且占据一定优势;发现可能的潜在新分类单元6个;156株内生细菌中38株菌的发酵液具有抑菌活性,初筛阳性率为23.7%。【结论】蜘蛛抱蛋植物组织中含有种类多样的内生细菌,它们可能是抗菌生物活性次级代谢产物的有效来源。     

A potential antioxidant resource: Endophytic fungi from medicinal plants

Medicinal plants and their endophytes are important resources for discovery of natural products. Several previous studies have found a positive correlation between total antioxidant capacity (TAC) and total phenolic content (TPC) of many medicinal plant extracts. However, no information is available on whether such a relationship also exists in their endophytic fungal metabolites. We investigated the relationship between TAC and TPC for 292 morphologically distinct endophytic fungi isolated from 29 traditional Chinese medicinal plants. The antioxidant capacities of the endophytic fungal cultures were significantly correlated with their total phenolic contents, suggesting that phenolics were also the major antioxidant constituents of the endophytes. Some of the endophytes were found to produce metabolites possessing strong antioxidant activities. Several bioactive constituents from the fungal cultures and host plant extracts were identified. This investigation reveals that the metabolites produced by a wide diversity of endophytic fungi in culture can be a potential source of novel natural antioxidants.     

大花黄牡丹内生菌的分离鉴定及其抗菌活性菌株的筛选

采用研磨法从健康大花黄牡丹的根、茎、叶柄、叶和种子中进行菌种分离,依据其形态、培养特征及其他生物学特性对菌株进行初步鉴定;采用平板对峙法对分离的内生菌进行拮抗试验研究,并对强活性菌株进行16S rD-NA序列鉴定,以明确大花黄牡丹内生菌的种类,筛选对农作物病害有抑制作用的菌株.结果表明:(1)获得内生真菌188株,鉴定为10个属,以短蠕孢属(50％)、青霉孢属(18.6％)和曲霉孢属(12.3％)为优势种群.获得内生放线菌145株,以链霉菌属(98.6％)为优势种群.表明大花黄牡丹内生菌在数量和种类上存在极丰富的多样性,同时在不同组织存在一定的差异性.(2)抑菌试验结果显示,21.6％真菌对指示菌有抑菌作用,抑菌圈直径最大为10mm;27.8％放线菌对指示菌有抑菌作用,其中菌株PND31的抑菌活性较强,抑菌谱较广.(3)16S rDNA序列鉴定显示,菌株PND31与链霉菌属聚在一起,初步归为链霉菌属一个种.