荧光假单胞菌2P24中opgGH基因影响抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚的产生

【目的】抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)是生防菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) 2P24防治植物病害的关键因子,然而对2,4-DAPG生物合成的调控通路并未完全解析。【方法】前期利用Tn5随机突变的方法获得一株对棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)拮抗能力完全丧失的突变菌株W3,本研究利用基因互补等方法研究该突变体中被破坏的基因对菌株2P24分泌2,4-DAPG和其他生防相关性状的影响。【结果】Tn5插入位点及其序列分析表明突变菌株W3中Tn5破坏了opgG基因。鉴于opgG和opgH基因组成操纵子,利用同源重组技术构建了opgGH内缺失突变菌株。与野生菌株2P24相比,opgGH突变菌株中2,4-DAPG的产量显著降低。对其他生防相关性状的检测发现,突变opgGH基因并不影响群体感应系统(quorum sensing,QS)信号分子的产生、氢氰酸的产生以及生物膜的形成,但可抑制菌株2P24的游动性。转录融合实验进一步表明opgGH基因并不调控gacA基因及其调控...     

不同碳源对生防荧光假单胞菌2P24产抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚的影响

【目的】包括碳源代谢等不同环境因子可调控生防菌株生防相关因子表达,进而影响其防病效果。荧光假单胞菌2P24可防治多种植物病原真菌、细菌引起的土传病害,抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphoroglucinol,2,4-DAPG)是其主要生防因子之一。本文利用平板对峙法及遗传学方法研究不同碳源对菌株2P24产生2,4-DAPG的影响及相关的调控途径。【方法】利用平板对峙法检测了菌株2P24在添加葡萄糖、果糖和蔗糖等碳源的土豆浸液培养基中对棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的拮抗能力及菌株2P24中影响2,4-DAPG产生的相关基因的表达。另外,利用Tn5转座子对含有2,4-DAPG合成基因phl A报告质粒p970Gm-phl Ap的野生型菌株2P24进行随机突变,在果糖土豆浸液培养基中筛选提高phl A基因表达的突变菌株。【结果】平板对峙实验表明,菌株2P24以葡萄糖为碳源时其抑菌活性最强,蔗糖次之,而以果糖等为碳源时菌株2P24无抑菌活性;转录融合实验进一步表明葡萄糖可促进phl A基因的表达,果糖则不影响phl A基因的表达。在果糖土豆浸液培养基中,转座子随机突变实验获得了5株可明显提高phl A基因表达的突变菌株。Tn5插入位点和序列分析显示其中一个突变体是Tn5破坏了che B基因。转录检测表明与野生菌株相比,che B突变体中phl A基因的表达和2,4-DAPG的前体物质间苯三酚(phloroglucinol,PG)产量都显著提高。游动性实验发现突变che B基因可显著降低该菌株的游动性。【结论】上述结果表明菌株2P24中不同碳源在转录水平上可影响phl A基因的表达,进而影响2,4-DAPG产生。遗传学结果也显示,che B基因参与调控2,4-DAPG生物合成过程。     

荧光假单胞杆菌2P24中gacA、dsbA和phoP/phoQ基因对小RNA因子RsmZ的转录调控

Pseudomonas fluorescens 2P24是分离自麦田的植物病害生物防治菌株,产生抗生素2, 4-二乙酰基间苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol;2,4-DAPG）是其主要防病机制。菌株2P24中小RNA基因rsmZ正调控抗生素2,4-DAPG的产量。【目的】本文研究上游调控因子对RsmZ转录表达的影响,以进一步理解抗生素产生机制。【方法】构建了rsmZ: : lacZ的转录融合结构,将含有该结构的报告载体转入2P24的多个调控基因缺失突变体中,检测相应的缺失基因对rsmZ转录水平的调控作用。【结果】结果表明,反应调控因子GacA对rsmZ基因的转录具有正调控作用,二硫键合成蛋白DsbA对其负调控;双因子调控系统PhoP/PhoQ突变后,rsmZ基因的转录明显滞后。【结论】小RNA基因rsmZ在菌株2P24中受到多个基因的调控,并在信号传递网络中起到重要作用。     

荧光假单胞杆菌2P24中生防相关调控基因gacS的克隆和功能分析

荧光假单胞杆菌2P2 4菌株分离自小麦全蚀病自然衰退土壤,可产生多种次生抗菌物质,对一些作物土传病害具有较好的防治能力。通过PCR介导的方法从荧光假单胞杆菌2P2 4的基因组文库中克隆到调控基因gacS。序列分析发现,该基因长度为2 75 4bp ,编码917个氨基酸的肽链。此肽链与Pseudomonaschlororaphis双因子组分之一的感受激酶GacS相似性达91% ,与P .fluorescensCHA0的GacS相似性为89%。与野生菌株2P2 4相比,gacS基因的缺失突变体完全丧失产生抗菌代谢物2 ,4_二乙酰基间苯三酚、氢氰酸、蛋白酶的能力。拮抗试验中,gacS缺失突变体丧失对小麦全蚀病菌的拮抗作用,温室生物测定显示gacS的缺失突变体对小麦全蚀病的生防能力大幅下降。但是gacS基因的互补突变体能够恢复产生抗菌次生代谢物的能力,且重新获得拮抗能力和生防能力。由此证明GacS是生防菌株2P2 4中一个控制生防因子并影响生防效果的重要调控元件。     

抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚作为荧光假单胞菌2P24菌株生防功能因子的实证分析

荧光假单胞杆菌2P24菌株分离自小麦全蚀病自然衰退土壤,它是酚类抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)的高产菌,对多种土传病害具有较好的防治能力。利用同源重组构建2,4-DAPG合成基因的定位突变体,并对突变体进行基因互补,通过检测突变菌株和恢复突变菌株抗生素产量和生防效果确定2,4-DAPG在菌株2P24生防功能中的作用。实验中,定位突变体丧失产生抗生素和拮抗病原菌的能力,而恢复突变体的抗生素产量和拮抗能力均恢复至野生菌水平。在对番茄青枯病的防病试验中,2,4-DAPG突变体的防效低且下降快,而恢复突变体的生防能力与野生菌相当,且效果稳定。由此可确定2,4-DAPG是菌株2P24防治番茄青枯病的主要因子,在防效上起关键作用。     

荧光假单胞菌2P24中PcoI-PcoR群体感应系统的自体反馈调控

荧光假单胞菌2P24的PcoI-PcoR 群体感应(QS)系统信号合成基因pcoI的表达受多种因子的调控, 其中GacS-GacA双因子调控系统在转录水平正调控信号合成基因pcoI的表达。为进一步研究QS系统调控因子, 将2P24基因组文库转入gacA缺失的pcoI基因转录报告菌株PM203 (pcoI-lacZ, gacA-), 筛选可提高pcoI表达的基因。结果表明粘粒pP32-24可显著提高pcoI转录水平, 亚克隆实验证明其中的功能基因为pcoI; 外源添加标准信号分子3-氧-己酰高丝氨酸内酯(3-oxo-C8-HSL)同样可显著提高pcoI基因的表达, 表明pcoI基因的表达对自身有正调控作用。同时构建了QS系统的另外一个组分pcoR基因的缺失突变体, pcoR基因缺失后pcoI的表达和N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子(AHL)的产量明显低于野生菌株及其互补菌株, 并显著降低该菌株的生物膜(Biofilm)形成能力。这些结果表明菌株2P24的PcoI-PcoR QS系统中, 信号合成基因pcoI的表达受自体反馈调控, pcoR基因参与pcoI基因表达的调控以及生物膜的形成。     

生防假单胞菌2P24中mvaT和mvaV基因对PcoI/PcoR群体感应系统的调控作用

【目的】自小麦全蚀病自然衰退土壤分离得到的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)2P24,可防治多种由植物病原菌引起的土传病害。菌株2P24具有群体感应(quorum-sensing,QS)系统PcoI/PcoR,该系统影响生防菌2P24生物膜的形成以及其在小麦根围的定殖能力,从而影响2P24的生防能力。本文利用遗传学方法进一步研究了2P24中QS系统的调控途径。【方法】将QS系统信号合成基因pcoI的转录报告质粒p970Gm-pcoIp转入gacA基因突变菌株PM201中,再利用Tn5转座子对该菌株进行随机突变,筛选影响pcoI基因表达的调控因子。【结果】根据菌落颜色的变化筛选到2株突变菌株。Tn5插入位点和基因序列分析表明这2个突变体中Tn5破坏了同一个基因mvaT;设计引物利用PCR方法从2P24基因组中获得mvaT基因及其同源基因mvaV。转录融合报告实验表明:与野生菌株2P24相比,mvaT及mvaV突变体中pcoI基因的表达和N-乙酰高丝氨酸内酯的产量显著提高;HPLC试验表明mvaT和mvaV基因影响抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚的合成。细菌双杂交试验证实,MvaT蛋白和MvaV蛋白在体内发生自身互作,这两个蛋白也可相互作用。【结论】以上结果表明mvaT和mvaV参与调控生防假单胞菌2P24的PcoI/PcoR群体感应系统,并可能影响其生防功能基因的表达。     

Gac系统中gacS基因的缺失对东湖假单胞菌HYS毒性的影响

细菌致病因子是细菌毒性的重要部分。Gac系统是细菌的一种全局性调控系统,调控着细菌多种毒性因子的产生。在前期研究中,首次从武汉东湖水域分离得到一株具备高产铁载体能力的革兰氏阴性菌--东湖假单胞菌（Pseudomonas donghuensis）HYS菌株。为了探索Gac系统对于HYS毒性的影响,首先通过氨基酸序列BlastP比对以定位HYS中Gac系统GacS蛋白的位置,经生物信息学分析,确定了HYS中存在Gac系统;再将来源于P. donghuensis HYS和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）PAO1的gacS片段分别通过基因克隆回补至HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中,并将获得的菌株喂食秀丽隐杆线虫,通过比较线虫的生存数量和生存天数来判断菌株毒性的强弱。结果表明,ΔgacS菌株毒性明显减弱,而2株回补菌株对线虫的毒性均有不同程度的恢复,说明HYS中的Gac系统参与了毒性调控途径,且P. aeruginosa PAO1的gacS片段也能在HYS中发挥一定的毒性调控作用。为了进一步探索ΔgacS菌株的减毒特性是否与HYS中毒力因子的丧失有关,利用脱脂牛奶平板检测菌株胞外蛋白酶的活性,并利用泳动运动平板、群集运动平板、蹭行运动平板检测菌株的运动能力,同时还对脂多糖、氢氰酸等代谢产物进行了检测。结果表明,相比于HYS,ΔgacS菌株的蛋白酶分泌完全消失,且3种运动能力相比HYS均显著下降（P<0.05）。此外,ΔgacS菌株的胞外脂多糖与氢氰酸的产量相比野生型HYS菌株也有不同程度的下降。而这些毒力因子表型在回补菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS中均可恢复至野生型水平,且回补PAO1的同源gacS基因甚至可在一定程度上回补gacS的正调控毒性物质的功能。研究表明,潜在的动物致病菌--P. donghuensis HYS通过Gac系统正调控产生毒性因子,从而发挥对秀丽隐杆线虫的致死效应,这为将来生物体抵御HYS感染提供了理论基础。     

铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA的缺失影响2个吩嗪基因簇的表达

[目的]为了研究铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA对两个吩嗪(Phenazine)合成基因簇phz1和phz2的调控方式与机制.[方法]采用基因缺失和抗性基因(gentamycin resistance cassette,aacC1)插入相结合的策略构建了rsmA基因缺失突变株PA-RG ;通过构建互补表达载体和过表达载体,进一步确认RsmA对绿脓菌素的调控作用 ;采用电转化方法将构建的翻译融合表达载体pMEZ1(phz1'-'lacZ)和pMEZ2(phz2'-'lacZ)分别导入铜绿假单胞菌突变株PA-RG和野生株PAO1,采用Miller法测定融合β-半乳糖苷酶活性.[结果]在GA培养基中,互补分析和过表达分析表明,RsmA抑制绿脓菌素的合成.此外,pMEZ1在突变株PA-RG中的表达增强,为野生株的2-3倍 ;而pMEZ2在突变株PA-RG中的表达降低,野生株是突变株的2倍.[结论]由此初步判定,铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA对两个不同吩嗪合成基因簇的调控作用具有特异性,在一定程度上RsmA负调控phz1,正调控phz2.     

假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控

假单胞菌株M18分泌藤黄绿脓菌素 (Pyoluteorin ,Plt )和吩嗪 1 羧酸 (Phenazine 1 carboxylicacid ,PCA)并抑制多种植物病菌的生长。从M18中克隆双基因调控系统gacS gacA的组成基因gacA ,并构建了该基因抗性插入突变株M18G。在KMB培养基中 ,M18G合成Plt的能力受到完全抑制 ,而PCA的积累约比野生型提高 31倍左右。Plt合成基因簇突变株M18T和在M18G基础上构建的PCA合成基因簇突变株M18GA的Plt和PCA合成的动力学变化表明 ,在M18G菌株中 ,Plt合成的抑制并不引起PCA的过量积累 ,PCA的过量积累也不引起Plt合成的抑制。由此推测 ,gacA在基因表达的水平上全局性地执行着调控功能     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.