首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
   检索      
共有20条相似文献,以下是第1-20项 搜索用时 343 毫秒

1.  我国D2-43病毒株PrM-E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性(英文)  被引次数:1
   陈水平  秦鄂德  于曼  胡志君  赵卫  范宝昌  王鹏程  杨佩英《中国生物化学与分子生物学报》,2002年第18卷第2期
    观察含我国登革 2型病毒株 (D2 4 3)的PrM E基因的复制型SFV(semlikiforestvirus)重组质粒DNA的免疫原性 ,为登革新型疫苗的研制提供依据 .将PrM E基因自T载体上切下 ,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中 .将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK2 1细胞 ,用间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒特异蛋白的表达 .采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA ,然后以不同剂量通过肌肉多点注射途径免疫Balb c鼠 ,获得的鼠血清可与登革D2 4 3感染的C6 36抗原片起特异的抗原抗体反应 .结果表明 ,含登革 2型病毒PrM E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb c鼠中可诱导登革 2型病毒特异抗体的产生 ,但抗体水平较低 .    

2.  登革2型PrM基因的重组病毒对不同型别登革病毒复制的阻断作用  
   于曼  秦鄂德  陈水平  赵月峨  范宝昌  段鸿元  姜涛  杨佩英  胡志君《中国生物化学与分子生物学报》,2002年第18卷第5期
    观察登革 2型PrM基因的pSFV重组甲病毒抗该型病毒的作用 ,进一步探讨登革 2型PrM基因的这种重组病毒对其它 3个血清型登革病毒复制的阻断作用 .采用体外转录和电穿孔 ,分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒 .再将激活的重组病毒感染细胞 ,分别用不同型病毒进行攻击 .然后通过免疫荧光法 ,观察对登革病毒复制的阻断作用 .结果表明 ,含登革 2型PrM基因的重组病毒不仅可阻断登革 2型病毒的复制 ,同样具有抑制其他 3个型病毒复制的能力 ,且抗登革 1、4型病毒的复制作用强于抗登革 3型病毒的作用 .用 10 3 TCID50 剂量的登革病毒攻击 ,含反义PrM基因的重组病毒可完全阻断登革 1、3、4型病毒的复制 .但含正义PrM基因的重组病毒对登革 3型病毒的复制不能完全阻断 .为探讨登革病毒防治新途径奠定了基础    

3.  稳定表达乙脑病毒结构蛋白的细胞系的建立  被引次数:1
   刘珊  黄莺  杨鹏  孙志伟  俞炜源《病毒学报》,2009年第4期
   以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组克隆质粒pBR-JTF为模板,通过PCR分别扩增prM-E及C-prM-E基因片段,构建表达乙型脑炎病毒结构蛋白的真核表达质粒pCJE-ME及pCJE-CME。将这2种重组质粒用脂质体法转染BHK-21细胞后,质粒pCJE-ME表现明显的细胞毒性,转染细胞不能存活;质粒pCJE-cME可导致筛选到表达JEV结构蛋白的稳定细胞系,这种稳定表达JEV结构蛋白的细胞系通过PCR扩增细胞系基因组、ELISA、Western Blot、间接免疫荧光等方法得到鉴定。研究结果表明在C蛋白存在下,乙型脑炎病毒C-prM-E蛋白可以在BHK细胞中稳定表达,为研制JEV新型复制子颗粒疫苗提供了便利工具。    

4.  登革3型病毒prM-E基因重组质粒DNA的构建和真核表达  
   段鸿元  陈水平  姜涛  秦成峰  邓永强  赵慧  于曼  秦鄂德《微生物学杂志》,2005年第25卷第1期
   构建登革 3型病毒 prM E基因的真核表达重组质粒 ,并进行体外表达 ,为登革DNA疫苗的研究奠定基础。用RT -PCR法获得 prM -E基因片段 ,然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒DNA转入BHK细胞 ,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达。结果 ,通过酶切和序列测定证实了构建的重组质粒DNA含序列正确的 prM- E基因。用免疫荧光法检测到转染了重组质粒DNA的BHK细胞的胞浆中有登革 3型病毒特异蛋白的表达。说明含有登革 3型病毒prM -E基因的真核表达重组质粒可以在BHK细胞中表达 ,该结果为观察该重组质粒的免疫原性奠定了基础。    

5.  登革2型病毒43株prM基因片段在痘苗中的克隆与表达  
   孙蕾  杨佩英  秦鄂德  于曼  徐品芳  阎国珍《生物技术通讯》,1998年第1期
   利用RT-PCR技术获得登革2型病毒中国分离株(D_2-43)的prM基因片段。扩增产物经酚:氯仿抽提纯化之后,直接插入pT_7BlueT载体中,经DNA序列分析证明了所扩增片段序列的正确性。构建了痘苗病毒载体PJSA1175/prM,外源基因受痘苗病毒启动子P_(7.5K)的调控。脂质转染(Lipofection)法获得D_2-43株prM蛋白的重组病毒。荧光检测显示,重组痘苗病毒表达的prM蛋白分布于细胞表面。间接ELISA测定其滴度为1:4。    

6.  我国D2-43病毒株PrM-E基因的重组SFV的制备及生物学鉴定  被引次数:6
   陈水平  秦鄂德  于曼  赵卫  胡志君  苑锡同  范宝昌  杨佩英《中国生物化学与分子生物学报》,2001年第17卷第6期
    为构建含PrM E基因的重组SFV病毒 ,将含我国登革 2型病毒PrM E基因的SFV表达载体和辅助载体DNA线性化后 ,进行体外转录 .然后将获得的 2种RNA转录物共转染BHK2 1细胞 ,以RT PCR法证明转染后的细胞培养上清中含有重组SFV .进一步将该重组病毒经蛋白酶激活后可使BHK2 1细胞产生细胞病变 ,并且以间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒所特有的蛋白 .含我国登革 2型病毒PrM E基因的重组SFV的获得 ,为进一步观察该重组病毒的免疫原性奠定了基础 ,从而为登革新型疫苗的研制提供新途径    

7.  乙脑/登革2型嵌合病毒的构建  
   韦艳  陆鹏  于建石  李建东  刘琴芝  张全福  李川  苗芳  张硕  杭小同  李德新《病毒学报》,2009年第3期
   在乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体pPartial△prM/E中克隆入DV2(Dengue virus serotype 2)的prM/E基因,构建乙脑/登革2型嵌合体克隆。将嵌合体克隆线性化后体外转录,获得的RNA转染BHK-21细胞,5~7d可观察到CPE。收获病毒上清液分别感染BHK-21细胞及C6/36细胞。接种于C6/36细胞中的嵌合病毒可使细胞出现CPE,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot检测显示:获得的嵌合病毒具有预期嵌合性核酸并能表达DV2的包膜蛋白,但不能在BHK-21细胞中传代培养。成功构建的乙脑/登革2型感染性克隆为进一步研究登革病毒疫苗奠定了基础。    

8.  登革2型病毒衣壳蛋白在哺乳动物细胞中的表达与鉴定  
   秦成峰  秦鄂德《生物技术通讯》,2005年第16卷第6期
   从构建的重组质粒pLEX—C中高保真PCR获得编码登革2型病毒43株C基/E/(D2C)DNA片段,通过基因重组的方法将其克隆入真核表达载体pcDNA6/V5-His获得了重组真核表达载体pc/D2C。经电穿孔的方法转染BHK21细胞后,分别通过RT—PCR、免疫荧光和western印迹鉴定表达的蛋白。结果重组蛋白在BHK21细胞中获得表达,表达的蛋自主要存在于胞浆中,并具有较好的抗原性,能够被抗登革病毒衣壳蛋白单克隆抗体特异识别。此研究为深入了解登革病毒衣壳蛋白在病毒复制及组装过程中的生物学功能奠定了基础。    

9.  登革2型病毒非结构蛋白NS4B及其突变体的真核表达与鉴定  
   赵慧  刘忠钰  秦成峰  秦鄂德《生物技术通讯》,2008年第19卷第4期
   目的:构建登革2型病毒非结构蛋白NS4B及其突变体Δ2K-NS4B基因的真核载体,并观察二者在哺乳动物细胞内的定位情况。方法:从登革2型病毒43株的全长cDNA克隆载体上扩增获得编码NS4B及缺失2K片段的NS4B突变体Δ2K-NS4B的基因;通过基因重组的方法分别将2段基因克隆入真核表达载体pcDNA6/V5-HisA,获得重组真核表达载体pc/D2-NS4B和pc/D2-Δ2K-NS4B;经脂质体法转染BHK-21细胞后,用RT-PCR、间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达的蛋白。结果:重组蛋白D2-NS4B和D2-Δ2K-NS4B可在BHK-21细胞中表达,二者均定位于细胞质中,并具有较好的抗原性,能够被抗登革2型病毒NS4B的多克隆抗体特异识别。结论:重组蛋白D2-NS4B和D2-Δ2K-NS4B在哺乳动物细胞胞质中的正确表达,为深入了解NS4B在登革病毒致病过程中的生物学功能奠定了基础。    

10.  登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究  
   高阳  江丽芳  方丹云  曾祥凤《Virologica Sinica》,2003年第18卷第3期
   将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80%的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E。间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达。ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1:640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4~+、CD8~+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4~+淋巴细胞水平略有上升。CD8~+细胞水平有较大升高(p<0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60%。以上结果表明:pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-I限制性杀伤性CD8~+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的。因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索。    

11.  登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究  
   高阳  江丽芳  方丹云  曾祥凤《中国病毒学》,2003年第18卷第3期
   将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80%的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E.间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达.ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4+淋巴细胞水平略有上升,CD8+细胞水平有较大升高(p<0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60%.以上结果表明pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-Ⅰ限制性杀伤性CD8+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的.因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索.    

12.  登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究  被引次数:4
   于曼 秦鄂德 赵卫 胡志君 苑锡同《微生物学报》,2001年第41卷第3期
   将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后将转染的宿主细胞用登革 2型病毒株攻击 ,并分别观察含正、反义PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒效果。通过碱基序列测定 ,筛选出含PrM基因正、反向插入的pSFV PrM重组质粒。并获得了经重组RNA与辅助RNA共转染细胞而产生的重组病毒颗粒。含有反义PrM基因的重组病毒RNA ,在宿主细胞中具有抗登革 2型病毒复制的作用 ,而且强于含正义PrM基因的重组病毒RNA。    

13.  人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究  被引次数:1
   刘源  张柯  谭文杰  王慧娟  舒跃龙  胡桂学  阮力《病毒学报》,2008年第24卷第6期
   将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒。为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高。将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体pIRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2。通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础。    

14.  可用于辅助蛋白功能研究的人呼吸道合胞病毒双顺反子微型基因组的构建及拯救  
   郑元博  张秀娟  许敏  姜男  彭向雷  付远辉  郑妍鹏  洪涛  何金生《微生物学报》,2017年第57卷第7期
   [目的]构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)双顺反子微型基因组cDNA克隆及重组质粒,并进行拯救,以探讨并验证RSV的聚合酶蛋白或辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用。[方法]利用全基因合成和分子生物学相结合的方法,在获得可分别表达EGFP和无生物活性蛋白的单顺反子微型基因组质粒pUC57-RSV-EGFP和pUC57-RSV-ORF1的基础上,进一步克隆至pBR322B载体,获得编码EGFP及无生物活性蛋白的双顺反子微型基因组质粒,经限制性内切酶和核酸序列分析正确后,与可表达4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达以及RT-qPCR对EGFP mRNA的转录水平进行定量分析。[结果]成功构建了编码EGFP和无生物活性蛋白的RSV双顺反子微型基因组质粒pBR322B-RSVⅡ-EGFP,经与编码4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,发现4种辅助蛋白对EGFP的表达具有不同的功能活性。[结论]以可表达EGFP报告基因的RSV双顺反子微型基因组重组质粒,实现了对4种辅助蛋白的功能验证,其中M2-1蛋白在双顺反子微型基因组拯救过程中具有转录延长的生物学活性。    

15.  流行性乙型脑炎病毒GSS株prM、E和NS1蛋白基因的克隆及在非复制型痘苗病毒中的表达  被引次数:4
   王文玲  陆柔剑  陆振华  王世峰  付士红  邓瑶  李仁清  辛伟  梁国栋  阮力《病毒学报》,2003年第19卷第3期
   克隆流行性乙型脑炎(乙脑)病毒野毒(JEV)GSS株前膜蛋白信号序列、前膜蛋白(prM)、包膜蛋白(E)、非结构蛋白-1(NSl)和非结构蛋白NS2a的编码基因,并与非复制型痘苗病毒载体NTV进行同源重组,构建了乙脑病毒非复制型重组痘苗病毒疫苗株NTVA(E/L)JEV。通过:PCR和Southern blot检测证明,在非复制型痘苗病毒中有乙暗病毒prM信号序列、prM、E、NS1和NS2a基因的插入:Western blot检测证明,重组病毒可以在细胞内成功地表达prM、E和NSl蛋白,并可将prM、E和NSl蛋白分泌到细胞培养上清中;免疫荧光检测证明,E和NSl蛋白主要分布在细胞膜上。电镜下可见分泌到细胞外的病毒样颗粒。    

16.  登革病毒包膜蛋白的原核表达及免疫原性研究  
   房树玉  吴艳花  崔晓云  范东瀛  安静《微生物与感染》,2014年第9卷第3期
   登革病毒感染引起的登革热和登革出血热/登革休克综合征是目前流行最为广泛的虫媒病毒病,但其发病机制不明,也无疫苗和特异性抗病毒药物用于防治.登革病毒包膜蛋白(E蛋白)在病毒致病和免疫过程中发挥重要作用.本研究构建了登革病毒2型E蛋白基因的重组质粒E/pGEX-6P-1,并优化表达条件,获得登革病毒E蛋白的高效可溶性表达;用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和层析柱纯化,获得纯度较高的蛋白.该蛋白具有较好的免疫原性,免疫小鼠后可获得高效价抗体.本研究为进一步了解登革病毒E蛋白的功能及其在相关疾病中的应用奠定了基础.    

17.  柔嫩艾美耳球虫重组鸡痘病毒的构建与免疫保护研究  
   杨桂连  李建华  张西臣  赵权  尹继刚《生物化学与生物物理进展》,2006年第33卷第11期
   以鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了杂交株F2的Rhomboid蛋白家族相关基因,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建出克隆质粒pMD-Rhomboid.以KpnⅠ、PstⅠ双酶切重组质粒pMD-Rhomboid和鸡痘病毒载体质粒pUTA2,并将纯化的Rhomboid基因亚克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游,构建出真核表达重组质粒pUTA-Rhomboid.采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR和蛋白质印迹等方法检测,筛选出一株球虫鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid.进一步经CEF扩增病毒后,免疫雏鸡,监测免疫指标.结果表明:重组病毒接种鸡外周血中的CD4 、CD8 含量显著高于非免疫对照组(P<0.05);与对照组相比,重组病毒对鸡的增重效果差异显著(P<0.05),对E.tenella的攻击具有一定的保护作用,显示出较好的应用前景.    

18.  表达登革病毒prM基因小干扰RNA的Vero细胞系的建立  
   李磊  吴新伟  伍业健  罗兰  蒋力云  杨霞《中国生物化学与分子生物学报》,2011年第11期
   prM蛋白是登革病毒膜蛋白M的前体,膜蛋白M对病毒的组装与成熟有重要作用,针对prM基因设计的小干扰RNA(siRNA)可短期抑制登革病毒复制.为了达到长期抑制登革病毒的效果,本研究构建了插入prM siRNA序列的重组慢病毒,利用流式细胞术分选以及杀稻瘟霉素抗性,筛选出稳定表达prM siRNA的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)系.经逆转录PCR及测序验证siRNA序列表达正确.Vero细胞中prM siRNA的表达率约为97.6%.当受到登革病毒攻击时,表达prMsiRNA的Vero细胞能够明显抑制登革病毒prM基因的表达,并抑制登革病毒在Vero细胞中的复制.建立的Vero细胞系可用于RNA干扰防治登革病毒感染的进一步应用研究.    

19.  抗登革病毒2型E蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定  
   陶萍  帅光泽  赖梅梅  王雪梅  郑健  黄爱龙《生物技术通报》,2008年第5期
   为了制备可用于胶体金快速检测试纸条的抗登革病毒2型(DEN2)E蛋白单克隆抗体(mAb),通过基因克隆获得E基因与质粒pET32a(+)的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPGT诱导表达重组蛋白。以DEN2重组E蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DEN2E蛋白的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类。结果表明获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(7C7),其抗体亚类为IgG1。Western blot显示该株mAb能特异识别重组pET32a-DEN2E蛋白。因此,成功制备出抗DEN2E的1株mAb,为建立快速特异橙测登革病毒感染的实验方法提供了有力的工具。    

20.  基于FMDV IRES的双顺反子载体的构建及体外表达分析  被引次数:1
   郑海学  郭慧琛  靳野  刘湘涛  谢庆阁《中国生物工程杂志》,2007年第27卷第8期
   利用RT-PCR扩增出口蹄疫病毒小核糖体进入位点(IRES)序列,并定向克隆进pcDNA3.1(+)载体,构建成双顺反子真核表达载体。为了验证该载体是否能够转录出双顺反子mRNA,在IRES起始密码(ATG)下游正确插入增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp),把重组质粒转染BHK-21细胞,培养20~48 h,在紫外显微镜下观察,能够看到典型的绿色荧光,表明载体能够体能够利用FMDV的IRES能够介导非帽依赖性表达外源基因。并通过流式细胞仪,与同样是CMV启动转录egfp的pGFPN1质粒在细胞中的表达的水平进行了比较。该载体的成功构建为体外表达双基因、双顺反子逆转录载体构建以及相关应用奠定基础,并有作为基因疫苗和标记定位基因治疗载体的潜力。    

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号