过氧化氢在水杨酸诱导的蚕豆气孔关闭中的作用

许多植物病原菌可通过气孔进入叶片组织,因此减小气孔开度有利于提高植物的抗性。我们通过表皮条分析和激光扫描共聚显微镜得到的证据表明在保卫细胞中过氧化氢可能是水杨酸信号的中间环节。SA可以浓度依赖的方式诱导气孔关闭（图1A）,H2O2也有类似的作用（图1B）。100μmol/L的水杨酸诱导的气孔关闭作用可明显地被20U/ml的过氧化氢酶或10μmol/L的Vc逆转,但CAT和Vc单独处理时诱导气孔开放的作用很微弱。单细胞中基于荧光探针DCFH的时间进程实验表明直接外加（图版I）或显微注射100μmol/L的SA均可诱导保卫细胞中H2O2产生,但以显微注射双蒸水作为对照时对DCFH荧光无影响（图版II）。这些结果暗示了植物被病原菌感染时可能通过产生H2O2导致气孔关闭而阻止病原菌继续通过气孔侵入。     

共聚焦显微技术研究SA对蚕豆气孔保卫细胞的影响

水杨酸(salicylic acid,SA)作为植物体内一种内源性的信号分子,具有多种生理功能.实验表明水杨酸以浓度依赖的方式诱导气孔关闭,抑制气孔张开.20U/mL的CAT与SA共同处理时可逆转SA诱导气孔关闭作用的83%~90%.以H2O2荧光探针H2DCFDA结合激光扫描共聚焦显微术直接检测到SA处理可引起保卫细胞内H2O2的产生;在保卫细胞内显微注射CAT可完全阻止SA导致的DCF荧光增强.表明SA诱导的气孔关闭可能与H2O2的产生有关.     

NADPH氧化酶参与水杨酸诱导的蚕豆气孔关闭过程

水杨酸(SA)可以浓度依赖的方式诱导蚕豆叶片的气孔关闭,1～1000μmol·L~(-1)SA所诱导的气孔关闭可以再开放,而10~(-2)mol·L~(-1)的SA导致的气孔关闭则否。质膜NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘(DPI)可削弱SA作用的45%～60%。表明SA诱导的气孔关闭可能与H_2O_2的产生有关。以H_2O_2荧光探针H_2DCFDA结合显微注射技术直接检测保卫细胞内产生H_2O_2的结果显示,100μmol·L~(-1)SA可引起保卫细胞内荧光素(DCF)荧光快速增强。在DPI存在的情况下,经SA处理的保卫细胞,仅在其叶绿体部位产生H_2O_2,而质膜附近的DCF荧光增强则受到抑制。表明叶绿体可能是保卫细胞内产生H_2O_2的主要部位,质膜NADPH氧化酶也可能参与SA诱导H_2O_2的产生。     

Ca2+参与水杨酸诱导蚕豆气孔运动时的信号转导

在一定条件下,外源水杨酸(SA)可以诱导蚕豆(Vicia faba L.)气孔关闭,阻止气孔张开。以Fluo-3—AM作为Ca^2 的荧光探针,利用激光共聚焦扫描显微技术,对水杨酸调控气孔运动中保卫细胞胞质Ca^2 的变化趋势及Ca^2 的来源进行了研究。结果表明,水杨酸可引起胞质Ca^2 增加,这种变化发生在气孔开度改变之前。Ca^2 螯合剂BAPTA（1,2-bis(2-amino phenox-y)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid,1mmol/L)几乎可以完全抑制水杨酸诱导气孔开度减小的作用;胞外Ca^2 螯合剂EGTA(2mmol/L)、质膜Ca^2 通道抑制剂尼群地平(nifedipine,NIF,1μmol/L)和LaCl3(1mmol／L)可不同程度地减弱水杨酸诱导气孔关闭的效应。BAPTA(1mmol／L)预处理后,水杨酸不再引起胞质Ca^2 含量改变;尼群地平能够降低水杨酸引起的胞质Ca^2 增加的幅度。说明Ca^2 可能参与水杨酸诱导气孔运动的信号转导。水杨酸引起胞内升高的Ca^2 可能既来自胞外又来自胞内,胞内Ca^2 库可能是其主要来源。     

NO可能作为H2O2的下游信号介导ABA诱导的蚕豆气孔关闭

ABA、H2O2和硝普钠(SNP)均能诱导蚕豆气孔关闭.NO的清除剂c-PTIO可以减轻由ABA或H2O2所诱导的蚕豆气孔关闭的程度,而过氧化氢酶(CAT)则不能减轻NO诱导的气孔关闭程度.激光共聚焦显微检测结果显示,10μmo1/L的ABA处理后,胞内H2O2的产生速率明显高于NO的产生速率;CAT几乎可完全抑制ABA所诱导的DAF的荧光增加;外源H2O2能显著诱导胞内DAF的荧光增加;c-PTIO对ABA诱导的DCF荧光略有促进作用,但外源SNP不能诱导胞内DCF荧光增加.这些结果表明,在ABA诱导气孔关闭过程中,H2O2可能在NO的上游起作用并受NO的负反馈调节.     

NADPH氧化酶可能参与了ABA诱导蚕豆气孔保卫细胞运动

研究了NADPH氧化酶在ABA（abscisic acid)诱导蚕豆气孔关闭信号转导网络中的作用,荧光光谱实验表明,在嗜中性白血球NADPH氧化酶抑制剂DPI(diphenyleneio-donium)存在的条件下,与对照相比,大大逆转了由ABA引起HPTS（8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid,trisodium salt)的荧光强度下降。表皮生物分析法显示,10^-6mol/L的DPI和10^3unit/mL的过氧化氢酶（catalase,CAT)在一定程度上也逆转了ABA诱导张开气孔的关闭。因此推测：在ABA诱导蚕豆气孔保卫细胞过程中,质膜上的NADPH气体酶可能催化形成超氧自由基O^-2,再经歧化反应形成H2O2,而形成的H2O2参与了气孔运动调节。     

过氧化氢对蚕豆气孔运动和质膜K+通道的影响

不同浓度H2O2可使蚕豆(ViciafabaL.)叶片气孔关闭,抑制气孔张开,10mmol/L的H2O2最有效,10μmol/L的H2O2仍明显使气孔关闭。且10μmol/L的H2O2抑制气孔张开作用能被EGTA所消除,表明Ca2+参与低浓度H2O2使气孔关闭的过程。2mmol/L的H2O2可使质膜内向K+通道电流明显减小,而外向K+通道电流显著增加。因此,H2O2促进蚕豆气孔关闭主要是通过抑制K+通过保卫细胞质膜内向流入,或加强K+外向流出实现的。     

H_2O_2介导H_2S诱导的拟南芥气孔关闭

以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料,研究了过氧化氢（H2O2）在硫化氢（H2S）调控气孔运动信号转导中的作用。结果表明,光下H2S的供体硫氢化钠（NaHS）能够诱导拟南芥气孔关闭;且能够显著提高叶片和保卫细胞胞质H2O2含量;H2O2的清除剂AsA和H2O2合成酶的抑制剂可不同程度地抑制NaHS诱导的拟南芥气孔关闭及叶片和保卫细胞胞质H2O2水平的升高;NaHS对AtrbohD、AtrbohF、Atpao2和Atpao4突变体气孔关闭、叶片和保卫细胞胞质H2O2水平升高的诱导作用要明显的小于野生型,但对AtPAO2和AtPAO4过表达株系叶片和保卫细胞H2O2水平的升高较野生型显著。据此推测,来源于NADPH氧化酶、细胞壁过氧化物酶和多胺氧化酶途径的H2O2参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭。     

NO和H2O2在光/暗调控蚕豆气孔运动中的作用及其相互关系

借助表皮条分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,对NO和H2O2在光/暗调控蚕豆(Vicia faba L.)气孔运动中的作用及其相互关系进行了探索.结果显示,光下外源NO供体硝普钠(SNP)和H2O2促进气孔关闭的效应明显大于暗中,暗中NO专一性清除剂2,4-羧基苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)、一氧化氮合酶(NOS)抑制剂NG-氮-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)和H2O2清除剂抗坏血酸(Vc)、过氧化氢酶(CAT)对气孔开度的效应明显大于光下,而且光下蚕豆保卫细胞NO和H2O2水平比暗中明显降低.上述结果表明,光/暗通过影响保卫细胞NO和H2O2的水平调控气孔运动.研究还发现,光下H2O2既诱导NO水平增加,也诱导气孔关闭,cPTIO和L-NAME有效地逆转H2O2的这些效应;光下SNP既诱导H2O2水平增加,也诱导气孔关闭,SNP的上述效应又被Vc和CAT有效逆转.这些结果表明,NO和H2O2在生成及效应上均存在明显的相互作用.另外,L-NAME显著逆转暗和光下H2O2处理对气孔关闭和NO生成的效应表明,蚕豆保卫细胞中可能存在NOS,暗和光下H2O2处理可能通过提高NOS的活性促进NO水平增加,进而诱导气孔关闭.     

SB202190调节蚕豆保卫细胞中SA诱导H2O2产生

运用激光共聚焦扫描技术,在p38MAP激酶专一抑制剂SB202190处理下,探索植物促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAP激酶）介导蚕豆（Vicia faba）保卫细胞中H2O2为代表的活性氧（reactive oxygen species,ROS）信号机制,发现：p38MAP激酶专一抑制剂SB202190处理没有导致蚕豆保卫细胞中H2O2和Ca^2＋探针荧光强度增强,与水杨酸（salicylic acid,SA）或脱落酸（abscisic acid,ABA）迅速加强2种探针荧光强度形成鲜明对比;而该抑制剂分别与SA和ABA共同处理,前者H2O2探针荧光强度没有增加,而后者荧光强度仍然能够增加;而进一步使用Ca^2＋螯合剂BAPTA和SB202190＋SA共同处理,H2O2探针荧光强度没有增加。这些结果初步表明：无论胞质Ca^2＋浓度高低,SB202190调节蚕豆保卫细胞中SA诱导H2O2产生,但是不调节植物逆境信使分子ABA此类的反应。因此推测,植物细胞中可能有类似动物和酵母细胞中的p38MAP激酶类,并可能专一调节植物保卫细胞中H2O2信号通路。据我们所知,这是首次报道SB202190和SA共同调节植物保卫细胞中ROS信号过程。     

过氧化氢对蚕豆气孔运动和质膜K+通道的影响

不同浓度H2 O2 可使蚕豆 (ViciafabaL .)叶片气孔关闭 ,抑制气孔张开 ,10mmol/L的H2 O2 最有效 ,10 μmol/L的H2 O2 仍明显使气孔关闭。且 10 μmol/L的H2 O2 抑制气孔张开作用能被EGTA所消除 ,表明Ca2 参与低浓度H2 O2 使气孔关闭的过程。 2mmol/L的H2 O2 可使质膜内向K 通道电流明显减小 ,而外向K 通道电流显著增加。因此 ,H2 O2 促进蚕豆气孔关闭主要是通过抑制K 通过保卫细胞质膜内向流入 ,或加强K 外向流出实现的     

拟南芥保卫细胞中茉莉酸甲酯诱导的H2O2产生与MAPK信号转导体系的可能关系

蛋白激酶MEK1/2的专一抑制剂PD98059可抑制茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的拟南芥保卫细胞中H2O2的产生和气孔的关闭.MeJA和H2O2诱导气孔关闭后,再用PD98059处理,可使关闭的气孔重新开放,同样,外源PD98059处理,能使MeJA诱导增强的H2O2探针的荧光强度降低.此结果表明,类属于MAPKK的蛋白激酶MEK1/2参与了MeJA诱导的拟南芥气孔关闭的信号转导过程,其作用机制可能是通过调节MeJA诱导保卫细胞产生和积累H2O2而起作用.     

UV-B对拟南芥叶片不同来源H2O2的活化和气孔关闭的诱导

在UV-B调控植物许多生理过程中过氧化氢(H2O2)作为第二信使发挥着重要作用,但H2O2来源途径并不清楚。该研究借助气孔开度分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,探讨H2O2在介导不同剂量UV-B诱导拟南芥叶片气孔关闭过程中的酶学来源途径。结果发现:0.5W.m-2 UV-B能诱导野生型拟南芥叶片保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭,且该效应能被NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘(DPI)抑制,而不能被细胞壁过氧化物酶抑制剂水杨基氧肟酸(SHAM)抑制,同时该剂量UV-B也不能诱导NADPH氧化酶功能缺失单突变体AtrbohD和AtrbohF以及双突变体AtrbohD/F保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭;相反,0.65 W.m-2 UV-B既能诱导野生型也能诱导NADPH氧化酶突变体保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭,且该效应能被SHAM抑制,却不能被DPI抑制。结果表明,不同剂量UV-B通过活化不同生成途径的H2O2来诱导拟南芥叶片气孔关闭,即低剂量UV-B主要诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF途径来源的H2O2生成,而高剂量UV-B主要活化细胞壁过氧化酶途径来源的H2O2。     

H2S位于H2O2下游参与乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程

H2O2和H2S是植物体内重要的信号分子,二者均参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭过程。以拟南芥野生型及其突变体为材料研究了H2O2和H2S在乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程中的相互关系。结果表明,乙烯能够诱导野生型拟南芥叶片H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(L-/D-CDes)活性显著增加,促进气孔关闭,但对H2O2合成突变体AtrbohD、AtrbohF、Atpao2和Atpao4植株叶片无显著作用;乙烯亦可引起H2S合成突变体Atl-cdes和Atd-cdes气孔保卫细胞H2O2水平的显著增加,但对其气孔运动没有显著作用。此外,H2O2清除剂和合成抑制剂均能抑制乙烯诱导的拟南芥叶片H2S含量和L-/D-CDes活性的增加及气孔开度的减小;而H2S清除剂和合成抑制剂虽能抑制乙烯诱导的气孔关闭,却不能改变乙烯对拟南芥叶片气孔保卫细胞H2O2的作用效应。由此表明H2S位于H2O2下游介导乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程。     

水杨酸调节决明根系铝诱导的氧化胁迫

水杨酸(Salicylic acid,SA)在调节生物和非生物胁迫,诱导植物氧化胁迫中起着重要的作用,但对铝诱导的氧化胁迫的调节作用尚不清楚.本文研究了SA对决明(Cassiatora L.)根系铝诱导的H2O2和O2-含量变化,包括抗氧化酶活性以及细胞质膜过氧化胁迫变化的影响.介质中20 μmol/L铝处理增加质膜透性,导致MDA含量上升及根尖细胞Evans blue染色加重(测定细胞死亡),而外源供给5 μmol/L SA能缓解铝诱导的氧化胁迫.SA处理能明显降低根尖H2O2和O2-的含量,但两者含量与CAT、APX和GR的活性变化没有相关性,而与POD活性增加有关.水杨酸诱导H2O2含量的下降与抑制O2积累和SOD活性有关.结果表明,SA可能激活一条由H2O2介导的、依赖于POD的抗氧化机制来缓解脂质的过氧化作用.     

二苯乙烯苷抑制过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：研究二苯乙烯苷（TSG）对过氧化氢（H2O2）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的保护作用。方法：运用四甲基偶氮唑盐还原法（MTT法）和流式细胞术筛选建立细胞凋亡模型的H2O2合适浓度以及检测不同浓度TSG对H2O2诱导HUVECs的增殖率和凋亡率;Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态。结果：MTT及流式法筛选300μmol/L为H2O2作用于细胞的最适凋亡浓度。MTT和流式结果显示,与H2O（2300μmol/L）损伤组比较,10μmol/L与100μmol/LTSG预处理组细胞的增殖率增加（P〈0.05）,凋亡率显著降低（P〈0.01）;Hoechst33258染色观察TSG能降低H2O2诱导的细胞凋亡,使细胞凋亡数减少。结论：TSG能抑制H2O2诱导的HUVECs凋亡,从而起到保护血管内皮细胞的作用。     

H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的蚕豆气孔关闭

以蚕豆（Vicia faba）为材料,利用激光共聚焦显微技术和分光光度技术,结合药理学实验,探讨硫化氢（hydrogen sulphide,H2S）和过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）在茉莉酸（jasmonic acid,JA）调控气孔运动信号转导中的作用。结果表明,H2S合成抑制剂氨氧基乙酸（aminooxy acetic acid,AOA）、羟胺（hydroxylamine,NH2OH）、丙酮酸钾（potasium py-ruvate,C3H3KO3）和氨水（ammonia,NH3）,H2O2清除剂抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）,合成抑制剂水杨羟肟酸（salicylhydroxamic acid,SHAM）、二苯基碘（diphenylene iodonium,DPI）均可逆转JA诱导的气孔关闭效应。JA能够明显提高蚕豆叶片及保卫细胞中的H2O2水平、H2S含量和L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性;H2S合成抑制剂可抑制JA引起的叶片H2S含量的增加;而H2O2清除剂则可减弱JA对H2S含量变化和L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的诱导效应。以上结果表明H2S和H2O2均参与了JA诱导的蚕豆气孔关闭,且H2S（主要由L-/D-半胱氨酸脱巯基酶合成）可能作为H2O2的下游组分参与调控这一信号转导过程。     

SB202190 调节蚕豆保卫细胞中SA 诱导H2O2 产生

运用激光共聚焦扫描技术, 在p38 MAP激酶专一抑制剂SB202190处理下, 探索植物促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAP激酶)介导蚕豆(Vicia faba)保卫细胞中H2O2为代表的活性氧(reactive oxygen species, ROS)信号机制, 发现: p38 MAP激酶专一抑制剂SB202190处理没有导致蚕豆保卫细胞中H2O2和Ca2+探针荧光强度增强, 与水杨酸 (salicylic acid, SA) 或脱落酸 (abscisic acid, ABA) 迅速加强2种探针荧光强度形成鲜明对比; 而该抑制剂分别与SA和ABA共同处理, 前者H2O2探针荧光强度没有增加, 而后者荧光强度仍然能够增加; 而进一步使用Ca2+螯合剂BAPTA和SB202190 ＋SA共同处理, H2O2探针荧光强度没有增加。这些结果初步表明: 无论胞质Ca2+浓度高低, SB202190调节蚕豆保卫细胞中SA诱导H2O2产生, 但是不调节植物逆境信使分子ABA 此类的反应。因此推测, 植物细胞中可能有类似动物和酵母细胞中的p38MAP激酶类, 并可能专一调节植物保卫细胞中H2O2信号通路。据我们所知, 这是首次报道SB202190和SA共同调节植物保卫细胞中ROS信号过程。     

Ca2+位于H2O2上游参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程

以拟南芥为材料,利用药理学实验,结合分光光度法和激光共聚焦显微技术,研究了Ca2+在硫化氢(H2S)诱导拟南芥气孔关闭过程中的作用及其与过氧化氢(H2O2)的关系。结果表明： H2S诱导气孔关闭, Ca2+螯合剂EGTA和质膜Ca2+通道阻断剂硝苯地平(Nif)能不同程度抑制H2S诱导的气孔关闭,而内质网钙泵阻断剂毒胡萝卜素(Thaps)对H2S的作用无显著影响。由此推测, Ca2+参与调节H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程,且胞质中Ca2+来源于胞外Ca2+的内流。另外, H2S诱导拟南芥叶片NADPH氧化酶基因AtRBOHD和AtRBOHF以及细胞壁过氧化物酶基因AtPRX34表达增强,促进叶片和保卫细胞中H2O2积累, EGTA对此起抑制作用,而外源CaCl2处理上调AtRBOHD、AtRBOHF和AtPRX34的表达。表明Ca2+可能位于H2O2上游参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程。     

Ca2+位于H2O2上游参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程

以拟南芥为材料,利用药理学实验,结合分光光度法和激光共聚焦显微技术,研究了Ca2+在硫化氢(H2S)诱导拟南芥气孔关闭过程中的作用及其与过氧化氢(H2O2)的关系。结果表明:H2S诱导气孔关闭,Ca2+螯合剂EGTA和质膜Ca2+通道阻断剂硝苯地平(Nif)能不同程度抑制H2S诱导的气孔关闭,而内质网钙泵阻断剂毒胡萝卜素(Thaps)对H2S的作用无显著影响。由此推测,Ca2+参与调节H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程,且胞质中Ca2+来源于胞外Ca2+的内流。另外,H2S诱导拟南芥叶片NADPH氧化酶基因At RBOHD和At RBOHF以及细胞壁过氧化物酶基因At PRX34表达增强,促进叶片和保卫细胞中H2O2积累,EGTA对此起抑制作用,而外源Ca Cl2处理上调At RBOHD、At RBOHF和At PRX34的表达。表明Ca2+可能位于H2O2上游参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程。