RNA干扰下调PTEN表达对体外活化肝星状细胞α-微管蛋白及γ-微管蛋白表达的影响

目的: 探讨RNA干扰下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对体外活化肝星状细胞 (HSC) α-微管蛋白(α-tubulin)及γ-微管蛋白(γ-tubulin)表达的影响。方法: 2017年9月至2018年3月,以腺病毒为载体将靶向PTEN的RNA干扰序列—短发夹RNA (shRNA)转染体外培养的活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,实验分为3组:对照组(Control组, 以DMEM代替腺病毒液进行腺病毒转染)、Ad-GFP组(以对照空病毒Ad-GFP转染体外活化HSC)、 Ad-shRNA/PTEN组(以携带靶向PTEN的shRNA的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN转染体外活化HSC),每组设6个复孔。采用Western blot及实时荧光定量PCR技术检测各组HSC的PTEN蛋白及mRNA表达;免疫荧光法检测各组HSC的α-tubulin及γ-tubulin表达。结果: 与对照组及Ad-GFP组比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的PTEN蛋白及mRNA表达明显降低 (P＜0.05)。 HSC的α-tubulin主要表达于细胞浆,对照组和Ad-GFP组HSC的α-tubulin呈丝网状、辐射状均匀分布于细胞核周围,而Ad-shRNA/PTEN 组HSC的α-tubulin向细胞两端末梢逐渐聚集并在细胞两端稍增多;与对照组HSC的α-tubulin荧光积分光密度值(IOD) (40803.00±2006.59)及Ad-GFP组HSC的α-tubulin荧光 IOD (42302.50±2537.93)比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的α-tubulin荧光 IOD (101495.17 ±5005.39)明显升高(P＜0.05),而对照组与Ad-GFP组HSC的α-tubulin 荧光IOD比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 HSC的γ-tubulin也主要表达于胞浆,并在胞浆中有散在点状聚集,但Ad-shRNA/PTEN组HSC的γ-tubulin点状聚集更明显;与对照组HSC的γ-tubulin荧光IOD (20410.68±1815.53)及Ad-GFP组HSC的γ-tubulin荧光IOD (20137.50±1469.49)比较,Ad-shRNA/PTEN组HSC的γ-tubulin荧光IOD (41310.83±1544.68) 明显升高(P＜0.05),而对照组与Ad-GFP组HSC的γ-tubulin荧光IOD比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论: 下调体外活化肝星状细胞的PTEN表达可显著增加其α-微管蛋白及γ-微管蛋白表达,并引起上述微管蛋白在胞浆中的分布发生变化。     

γ-微管蛋白研究进展

概述了近年来对γ-微管蛋白复合体结构、分子机制以及功能的研究进展.γ-微管蛋白是真核生物体内一种重要的保守性功能蛋白,以γ-微管蛋白小复合体和γ-微管蛋白环式复合体两种形式存在.通过γ-微管蛋白复合体结合蛋白定位于微管组织中心,参与微管的晶核起始以及有丝分裂纺锤体的组装等细胞功能.     

SH-SY5Y细胞α-突触核蛋白的过表达可部分抵抗鱼藤酮诱导的氧化应激

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的发病机制涉及到遗传和环境因素。环境因素通过线粒休导致氧化应激和α-突触核蛋白（α—synuclein）聚集,但其确切的作用机制尚不明确。本文利用过表达α-突触核蛋白-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein．EGFP）的人多巴胺能神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y为模型,研究α-突触核蛋白对鱼藤酮诱导氧化应激的影响,从而进一步了解α-突触核蛋白和细胞存活之间的关系。（1）用荧光显微镜观察融合绿色荧光蛋白的α-突触核蛋白的表达情况;（2）用实时定量PCR检测α-突触核蛋白基因的表达;（3）用免疫细胞化学测定α-突触核蛋白的分布;（4）用不同浓度的鱼藤酮作用细胞后,以MTT法测细胞的活力、DCF法检测细胞的氧化应激状态、黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶的活力,并用流式细胞仪分析细胞的凋亡。实时定量PCR结果显示,α-突触核蛋白基因表达量在α-突触核蛋白过表达的细胞要高于SH—SY5Y细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白和α-突触核蛋白的表达。鱼藤酮可使细胞活力下降、线粒体complex Ⅰ的活性降低,诱导细胞内氧化应激,而过表达α-突触核蛋白的细胞可以部分抵抗鱼藤酮的毒性作用,表现为细胞抗氧化能力迅速增高（P〈0．05）和鱼藤酮诱导的细胞凋亡数目明显降低。本研究证明α-突触核蛋白对鱼藤酮产生的氧化应激有部分抵抗作用,而使过表达α-突触核蛋白的SH—SY5Y细胞对鱼藤酮的毒性作用表现出一定的耐受性。这种耐受性也可能是细胞对外界损害的一种代偿反应,从而促进细胞的存活。     

靶向微管抗肿瘤药物研究进展

微管由微管蛋白组成,在细胞分裂、细胞内物质运输、信号传递、维持细胞形态等过程中起着重要作用.一些干扰微管功能的化合物可使细胞停滞在有丝分裂期而抑制细胞增殖.相对于正常细胞,肿瘤细胞有丝分裂异常频繁,以微管作为抗肿瘤的靶点已成为研究热点.作用于微管的微管蛋白抑制剂通过抑制微管蛋白的聚合促进微管解聚或者抑制微管解聚促进微管蛋白聚合来破坏微管动态平衡、干扰肿瘤细胞纺锤体形成、阻断细胞分裂、抑制肿瘤增殖,现就微管蛋白抑制剂的研究进展作一综述.     

α-突触核蛋白的结构生物学研究

α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)聚集形成纤维状结构，进而形成路易小体(Lewy bodies, LBs)。LBs是帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、多系统萎缩(multiple system atrophy, MSA)和路易小体痴呆(dementia with Lewy bodies, DLB)等神经退行性疾病的典型细胞病变特征，也是发病的一个关键环节。近年来，冷冻电镜技术的进步使解析高分辨率α-突触核蛋白原纤维结构成为可能。对α-突触核蛋白不同聚集形态的深入探究，能为理解神经退行性病变的分子机制、α-突触核蛋白毒性形式的性质以及α-突触核蛋白聚集影响的信号途径等提供帮助。本文综述目前已知的不同形态α-突触核蛋白结构，阐述α-突触核蛋白单体、寡聚体和不同聚集形式原纤维的结构特征。α-突触核蛋白寡聚体由于其结构不稳定，目前尚无明确的结构信息。但目前已有多个α-突触核蛋白原纤维结构被解析，包括重组蛋白体外制备的和多系统萎缩(MSA)患者体内分离的原纤维。这些原纤维直径由5 nm的单股原纤维至10 nm的双股原纤维不等。不同的体外制备条件可生成...     

α-突触核蛋白的核易位机制及其功能

α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)是一种脑内含量丰富的可溶性蛋白质,既能参与正常突触功能的维持和囊泡运输,又与多种神经退行性疾病有关,然而其确切的功能目前仍未完全清楚。已有研究表明,在生理条件下,α-突触核蛋白主要定位在细胞质中,少部分能定位在细胞核中,具有多种生物学功能。在帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)患者大脑及氧化应激的细胞中,均发现α-突触核蛋白趋向于向细胞核中聚集。α-突触核蛋白核易位受到多种因素的精密调控,除自身氨基酸序列外,还受到其129位丝氨酸磷酸化(S129)水平、点突变(A53T, A30P, G51D)、细胞内Ca~(2+)水平的影响,以及核输入蛋α(importin-α)、三结构域蛋白28 (tripartite motif-containing protein 28, TRIM28)等多种蛋白质的精密调控,其异常的核易位则与细胞毒性相关。核易位的α-突触核蛋白能和组蛋白去乙酰化酶及组蛋白甲基化酶相互作用,从而改变组蛋白乙酰化和甲基化水平,最终影响染色质的稳定性。此外,α-突触核蛋白能与DNA相互作用,从而改变DNA构象、参与DNA损伤修复及基因表达调控。本文综述了α-突触核蛋白的结构特征,生理及病理条件下的细胞核内定位现象,详细的核易位机制及其在胞核中的功能研究进展,将有助于了解α-突触核蛋白生理功能及其在疾病发生发展中的作用。     

γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟和活化中的分布

微管蛋白(tubulin)是一蛋白质超家族,其中α-,β-微管蛋白是主要的微管蛋白,而γ-微管蛋白主要在微管组装中起作用. 我们利用蛋白质印迹和激光共聚焦技术研究了γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟、受精和活化中的分布. γ-微管蛋白存在于猪卵母细胞中,并且在减数分裂成熟各个时期的量保持不变. 它聚集在微管上,特别是中期纺锤体的两极和后末期的中板. 体外受精和孤雌活化后,γ-微管蛋白聚集在雌雄原核的周围.另外它也存在于精子的顶体帽和颈部.在早期卵裂中,γ-微管蛋白聚集在胚胎的细胞核周围.实验结果表明,γ-微管蛋白在猪卵母细胞、精子和胚胎的微管组装中起重要的调节作用,在猪受精过程中,精子和卵子都向受精卵贡献中心体物质.     

纤毛病相关蛋白CEP43和CCDC13在艾美游仆虫中的细胞与亚细胞定位北大核心CSCD

艾美游仆虫(Euplotes amieti)含有几乎所有已知的纤毛病基因,但绝大多数基因及其表达产物的细胞定位和功能未知。为明确中心粒蛋白43(CEP43)和卷曲螺旋域蛋白13(CCDC13)在艾美游仆虫中的细胞以及亚细胞定位,本研究采用免疫荧光和免疫电镜技术对其进行显微与超微结构观察。免疫荧光结果显示,CEP43主要定位于艾美游仆虫的细胞核、腹面纤毛器(口围带、尾棘毛、额腹横棘毛)的基体及其附属微管,CCDC13主要定位于腹面纤毛器杆部和基体以及银线系统,附属微管及大核未见其定位。CEP43与γ-微管蛋白定位相同,CCDC13与γ-微管蛋白仅在腹面定位相同。2种蛋白在免疫电镜下显示与荧光标记定位相同,而且CCDC13在额腹棘毛基部的胶体金数量远多于CEP43。结合已有研究推测,纤毛形成后多余的CEP43受γ-微管蛋白复合体调控且被募集于细胞核,CCDC13参与形成银线系统,但为增加生长期艾美游仆虫的微管再生能力,附属微管结构不需要CCDC13的参与。本结果为进一步研究上述蛋白在腹毛类纤毛虫中调节和维持皮层微管类细胞骨架的装配和稳定性中的作用和机制提供资料。     

研究解析与神经退行性疾病密切相关蛋白

中国科学院生物物理研究所脑与认知科学国家重点实验室的研究人员发现一种与神经退行性疾病密切相关的蛋白——突触核蛋白α-synuclein的硝基化聚集物具细胞毒性。     

γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟和活化中的分布(英)

微管蛋白（tubulin）是一蛋白质超家族,其中α-,β-微管蛋白是主要的微管蛋白,而γ-微管蛋白主要在微管组装中起作用. 我们利用蛋白质印迹和激光共聚焦技术研究了γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟、受精和活化中的分布. γ-微管蛋白存在于猪卵母细胞中,并且在减数分裂成熟各个时期的量保持不变. 它聚集在微管上,特别是中期纺锤体的两极和后末期的中板. 体外受精和孤雌活化后,γ-微管蛋白聚集在雌雄原核的周围.另外它也存在于精子的顶体帽和颈部.在早期卵裂中,γ-微管蛋白聚集在胚胎的细胞核周围.实验结果表明,γ-微管蛋白在猪卵母细胞、精子和胚胎的微管组装中起重要的调节作用,在猪受精过程中,精子和卵子都向受精卵贡献中心体物质.     

促进或抑制α-synuclein蛋白异常聚集的相互作用蛋白质

α-synuclein蛋白的异常聚集在共核蛋白病的发病过程中起到了关键性作用。与α-synuclein相互作用的蛋白质对其异常聚集起着不同的调节作用,有的蛋白质(如:蛋白synphilin-1、微管蛋白、A-β肽等)会促进α-synuclein蛋白的异常聚集,而另外一些蛋白质(如:膜联蛋白A5、基于自识别元素设计的小肽等)却能够抑制α-synuclein蛋白的异常聚集。认识与α-synuclein相互作用的蛋白,并研究其作用位点,是从分子水平上理解α-synuclein蛋白质异常聚集、揭示共核蛋白病致病机制,以及设计新药物的基础。分子动力学模拟为开展这方面研究开辟了新的途径。文章对该领域的研究进展进行了综述。     

Bmi-1稳定干扰增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性

目的:观察Bmi-1稳定干扰后对乳腺癌细胞药敏性的影响.方法:构建Bmi-1 shRNA逆转录病毒表达载体,并用该逆转录病毒感染人乳腺癌细胞,建立Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞株.采用不同浓度的化疗药物5-氟尿嘧啶和顺铂处理上述细胞,MTT法观察乳腺癌细胞的生长抑制率.结果:免疫印迹检测结果表明Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞株成功建立.MTT检测显示Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞(MDA-MB-435S-Bmi-1/RNAi)增殖抑制率显著高于对照细胞(MDA-MB-435S-vector)(P<0.05),并且呈浓度依赖性.其中在MDA-MB-435S-vector中5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50值分别为1.7233 mg/L和2.9065 mg/L,而在MDA-MB-435S Bmi-1/RNAi稳定细胞株5-氟尿嘧啶和顺铂中的IC50值分别为0.9733 mg/L和1.8563mg/L(P<0.05).结论:Bmi-1在乳腺癌细胞对化疗药物敏感性中发挥重要作用,Bmi-1干扰能增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性.     

生物体内的γ-微管蛋白

γ-微管蛋白在真核生物体内以γ-微管蛋白环式复合体和γ-微管蛋白小复合体两种形式存在.γ-微管蛋白在真核生物体内的主要功能是参与微管晶核形成、有丝分裂纺锤体的形成以及细胞周期调控等.该文重点介绍植物体内的γ-微管蛋白所行使的功能.     

小鼠孤雌胚早期发育过程中γ-微管蛋白的动态变化

微管蛋白是构成微管的主要蛋白,其中α、β亚单位形成异二聚体,而γ-微管蛋白在微管组装中起作用。为了研究小鼠早期孤雌胚中廿微管蛋白的动态变化,本实验采用了免疫荧光化学染色与激光共聚焦显微镜观察相结合的方法,在SrCl2激活的卵母细胞减数分裂以及早期孤雌胚有丝分裂过程中对γ-微管蛋白进行了定位观察。结果显示,SrCl2和细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）诱导的第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ ofmeiosis,MII）小鼠卵母细胞恢复减数分裂,并且纺锤体始终与质膜平行,表明纺锤体旋转被抑制,但核分裂不受影响。减数分裂过程中γ-微管蛋白主要定位于中期纺锤体两极和后期分开的染色单体之间;孤雌活化两雌原核形成以后,γ-微管蛋白聚集在两雌原核周围。在早期孤雌胚有丝分裂间期无定形的γ-微管蛋白均匀分布于核;前中期γ-微管蛋白向两极移动,遍布于整个纺锤体区。有丝分裂中期、后期和末期廿微管蛋白的分布变化与减数分裂相似。结果表明,SrCl2和CB激活的MII卯母细胞产生杂合二倍体;γ-微管蛋白具有促微管负极帽形成和稳定微管的功能,从而促进纺锤体的形成;分裂后期和末期廿微管蛋白的重新分布可能是由纺锤体牵引同源染色体分离所诱导的：γ-微管蛋白负责两雌原核的迁移靠近。     

p38信号通路参与LPS诱导的Raw264.7细胞骨架重构

应用免疫荧光标记、基因转染等方法,观察脂多糖（LPS）刺激对单核细胞系Raw264.7细胞骨架的影响,探讨p38家族不同亚型对LPS诱导的细胞骨架蛋白微管蛋白与肌动蛋白变化的调控作用结果显示,未受LPS刺激的细胞富含微管蛋白,微管蛋白交联形成辐射状的交联丝网,丝网在细胞中分布均匀;LPS刺激后,微管蛋白募集在细胞膜、核膜周围;p38α、p38β、p38γ亚型的特异性抑制剂FHPI对LPS诱导的微管蛋白募集无影响,而p38无活性突变体p38δ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞骨架微管蛋白的募集;肌动蛋白在静息的细胞内主要存在于细胞膜周围,LPS作用后,肌动蛋白在细胞中形成广泛分布的辐射状应激纤维;p38上游激酶活性诱变体MKK6b基因转染可诱导Raw细胞形成类似的应激纤维,而p38γ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞应激纤维的形成.上述结果表明,p38δ可能参与了LPS诱导的微管蛋白的重构;而LPS诱导Raw细胞应激纤维的形成,可能是通过p38γ蛋白激酶而发挥作用.     

健康神经细胞移植会表现帕金森病特征

研究者发现,将健康的神经细胞移植到帕金森病病人脑中,该病可传播到移植的神经细胞中.在尸体解剖研究中,研究者发现3个帕金森病人中极少数移植细胞获得了帕金森病的特征,但在5个其他接受移植者中,所移植的神经元在病人死亡前表现正常,并仍有功能,此距离手术已有16年.该发现意味着用干细胞可治疗帕金森病,这就提议可以将健康的神经细胞移植到病人脑中去,以取代被帕金森病损伤的脑细胞,这种疗法并能部分缓解症状,主要是病人肢体运动机能失控的症状.在该项研究中,医师从类胚胎干细胞中,而不是从人的胎儿中获取新神经细胞.大多数移植的神经元能健康存活下来,预示干细胞方法的可行性.但是科学家需要了解为什么有些细胞意外地发生类帕金森病.有一组3项研究发表在在线2008年4月6日的Nature Medicine上,研究由瑞典、英国、加拿大和美国的几位科学家做的,他们在移植接受者脑中搜寻细胞中是否含有α 突触核蛋白(alpha-synuclein)凝块.在神经细胞中出现这种凝块是帕金森病的常见特征.在3个相关病人中,仅有2～5%移植的神经细胞中含有这种α-突触核蛋白凝块.这就提示在移植过程中需化几十年时间才能使大多数移植细胞含有α-突触核蛋白凝块.研究者说,现在尚不清楚,为什么有些移植细胞会发生α 突触核蛋白凝块.有人提示在靠近移植的病变脑区中,α-突触核蛋白存在会诱导产生更多的一种链状反应蛋白质.有一位科学家,他曾做过61例将神经细胞移植到帕金森病人的手术,但他未参加该项新研究.他评论道,α-突触核蛋白的出现也可以用其它原因来解释,例如,在移植期间加压于细胞便可引起细胞生长出差错而产生α-突触核蛋白.α-突触核蛋白与帕金森病之间的联系问题仍有争论,因为α-突触核蛋白有时在非帕金森病的人神经细胞中也可以找到.这正表明了这些移植方法是多么复杂,但这并不意味着干细胞移植对帕金森病是无用的.(李潇摘译自Patrik Barry:Science News, April 12,2008,Vol.173,p.229)     

经体外缺失诱变组建人杂交干扰素αA/γ

使用寡核苷酸指导的定点突变方法,将人αA型干扰素的完整基因与γ干扰素C端16个氨基酸的编码序列融合,在噬菌体λP_L启动子控制下,合成了一个杂交蛋白质。此蛋白质经抗人α干扰素单克隆抗体纯化后,在MDBK细胞上具有抗病毒活性,并像γ干扰素一样,可被依赖于cAMP的蛋白激酶磷酸化。[γ-~(32)P]杂交蛋白与MDBK细胞的结合,可被αA型干扰素大大抑制(70％)。     

P38在LPS诱导大鼠雪旺氏(Schwann) 细胞TNF-α表达中的作用

应用免疫荧光标记、基因转染等方法,观察脂多糖（LPS）刺激对单核细胞系Raw264.7细胞骨架的影响,探讨p38家族不同亚型对LPS诱导的细胞骨架蛋白微管蛋白与肌动蛋白变化的调控作用结果显示,未受LPS刺激的细胞富含微管蛋白,微管蛋白交联形成辐射状的交联丝网,丝网在细胞中分布均匀;LPS刺激后,微管蛋白募集在细胞膜、核膜周围;p38α、p38β、p38γ亚型的特异性抑制剂FHPI对LPS诱导的微管蛋白募集无影响,而p38无活性突变体p38δ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞骨架微管蛋白的募集;肌动蛋白在静息的细胞内主要存在于细胞膜周围,LPS作用后,肌动蛋白在细胞中形成广泛分布的辐射状应激纤维;p38上游激酶活性诱变体MKK6b基因转染可诱导Raw细胞形成类似的应激纤维,而p38γ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞应激纤维的形成.上述结果表明,p38δ可能参与了LPS诱导的微管蛋白的重构;而LPS诱导Raw细胞应激纤维的形成,可能是通过p38γ蛋白激酶而发挥作用.     

副监护子CHIP与神经退行性疾病

CHIP属于连接酶类,具有E3泛素连接酶活性,参与能量代谢途径和新陈代谢。包括阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)、帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)、亨廷顿病(Huntington'sdisease,HD)等在内的神经退行性疾病的主要病理学特征之一——细胞中异常蛋白的聚集,如tau蛋白和α-突触核蛋白等,副监护子CHIP与分子伴侣,如Hsc70/Hsp70、Hsp90等相互作用对这些异常蛋白的产生具有调节作用。最近研究表明,CHIP改变了Hsc70和Hsp90介导调节的信号通路中蛋白折叠和降解的平衡,参与细胞内蛋白质的质量控制;Hsp70/CHIP伴侣系统在tau蛋白生物学和tau蛋白病理学机制中具有重要作用;CHIP可以作为α-突触核蛋白蛋白酶体降解途径和溶酶体降解途径的分子开关。这些研究进展对于进一步揭示神经退行性疾病的发病机制和研制新一代治疗药物具有重要的作用。     

不同亚细胞定位的alpha-突触核蛋白对SK-N-SH细胞的毒性影响

在帕金森病中,alpha-突触核蛋白(α-synuclein)累积与聚集所产生的细胞毒性是发病的重要原因。本文目的是探求不同亚细胞定位的α-突触核蛋白对于细胞的毒性影响。分别在α-突触核蛋白前插入核输出序列(nuclear export sequence,NES)或核定位序列(nuclear localization sequence,NLS),使其特定地表达在细胞质或细胞核中。构建成功的质粒分别在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中表达,通过免疫荧光与Western印迹法检测蛋白质的表达情况。结果显示,NES-α-synuclein特异性地在细胞质中表达,NLS-α-synuclein特异性地在细胞核中表达。乳酸脱氢酶法检测结果表明,相较于WT-α-synuclein组,NES-α-synuclein组的乳酸脱氢酶的释放量减少26. 54%,NLS-α-synuclein组的乳酸脱氢酶释放量增加12. 85%。CCK8法检测细胞活性结果表明,相较于WT-α-synuclein组,NES-α-synuclein组的细胞活力提高35. 51%,NLS-α-synuclein组的细胞活力减少7. 93%。上述结果提示,胞质内表达α-synuclein对于细胞的毒性更小,而细胞核内表达的α-synuclein对细胞有更强的毒性作用。这些发现为研究帕金森病的分子机制提供了新的研究思路。