西伯利亚蓼rd22基因的克隆与序列分析

以3% NaHCO₃溶液胁迫处理48 h的西伯利亚蓼为试材,利用RACE技术,从其茎部组织克隆了脱水应答蛋白RD22的全长cDNA序列。测序后的结果分析表明,该cDNA序列全长为1 302 bp,5′非翻译区为59 bp,3′非翻译区为25 bp,开放读码框为1 218 bp,编码405个氨基酸。在氨基酸序列的C端含有一个比较保守的BURP结构域,N端含有5个重复序列THV-VGKGGV-V。信号肽检测证明该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽结构。其推演的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达到60%。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为DQ836050。     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

用木麻黄(Casuarina glauca)的金属硫蛋白基因(metallothionein 1)氨基酸序列对柽柳ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了柽柳金属硫蛋白基因全长cDNA序列,去除polyA后该基因全长366 bp,其中5′非翻译区97 bp,3′非翻译区59 bp,开放读码框(ORF)长210 bp,编码70 个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为6.793 kD,理论等电点为4.99,含10个Cys,集中分布在肽链的N端和C端。BlastP同源性分析表明该基因与花生同源性最高,与小豆同源性最低。该基因的EST序列在GenBank登录(登录号：CV792539)。     

TcLr35小麦中病程相关蛋白1基因的克隆及分析

根据已发表的植物病程相关蛋白1基因设计引物,利用RT-PCR技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个病程相关蛋白1基因cDNA片段,长度为489bp,3′端包含21个poly(A),暂命名为PR12。利用5′RACE技术获得了818bp的PR12全长,该基因包含495bp的开放读码框,147bp的5′非翻译区(non translated region,NTR),155bp的3′非翻译区和21bp的多聚腺苷酸尾。编码164个通读的蛋白质氨基酸序列,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与GenBank中多个植物病程相关蛋白1基因具有较高的同源性。Southern杂交显示,该基因在小麦基因组中为单拷贝。     

中国野葡萄新基因cDNA全长的克隆及序列分析

根据对中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下构建的cDNA文库中获得的1条EST序列设计特异引物,以总RNA逆转录产物为模板,进行SMART-RACE扩增。结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,并预测了蛋白质的理化性质、信号肽、酶与非酶分析、亚细胞定位以及蛋白质二级结构。结果表明,获得的中国野生葡萄新基因的全长序列为854 bp,其开放阅读框为585 bp,5′非编码区为107 bp,3′非编码区为162 bp;同源性比对表明该新基因推导的氨基酸序列与拟南芥RNA结合蛋白和水稻推定的半乳糖基转移酶的同源性分别为55%和63%,第8~82位氨基酸序列与RNA识别基序相类似,是一个典型的结构功能域;推导该基因表达产物为相对分子质量为21 801.27、等电点为6.86的不稳定蛋白,定位于细胞核,不包含信号肽,二级结构主要是无规则卷曲。     

用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3''''端序列

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。该研究从牛BMP4基因出发,以牛软骨的RNA为模板,按照不同物种BMP4基因的相似性设计特异引物,运用PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMP4的3′端序列,包含有1170bp组成的开放读码框(ORF),编码389个氨基酸,3′非编码区121bp个核苷酸和poly(A)15。同源性分析结果表明,牛BMP4 cDNA最大开放读码框所推测的氨基酸序列与已知人、小鼠、大鼠、狗、羊和鸡等真核生物BMP4氨基酸序列进行比较,分别有94.5%、93.1%、91.9%、87.4%、94.2%、79%的同源性。这为克隆其他物种的BMP4基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为我们更好的理解牛的生骨机理提供帮助。     

用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3′端序列

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。该研究从牛BMP4基因出发,以牛软骨的RNA为模板,按照不同物种BMP4基因的相似性设计特异引物,运用PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMP4的3′端序列,包含有1170bp组成的开放读码框(ORF),编码389个氨基酸,3′非编码区121bp个核苷酸和poly(A)15。同源性分析结果表明,牛BMP4 cDNA最大开放读码框所推测的氨基酸序列与已知人、小鼠、大鼠、狗、羊和鸡等真核生物BMP4氨基酸序列进行比较,分别有94.5%、93.1%、91.9%、87.4%、94.2%、79%的同源性。这为克隆其他物种的BMP4基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为我们更好的理解牛的生骨机理提供帮助。     

星星草cDNA文库构建和金属硫蛋白(MT-1)基因的克隆

以受NaHCO3胁迫后的星星草叶片组织为材料构建了cDNA文库,文库的初始滴度为2.0×106pfu,重组率为95%,平均插入片段长度为0.8kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu.mL-1.文库克隆随机测序获得了星星草的金属硫蛋白(MT-1)基因的全长cDNA序列,显示文库中含有一定量的全长基因.MT-1基因全长622bp,其中5'非翻译区57 bp,3'非翻译区343 bp,开放读码框长222 bp,编码73个氨基酸,氨基酸序列中具有植物MT-1蛋白特有的金属响应元件(MRE)序列,MT-1蛋白的分子量为7.814 kD,理论等电点为4.72.     

绞股蓝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

目的:克隆并分析绞股蓝法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因的全长序列。方法:参照罗汉果法呢基焦磷酸合酶基因,设计扩增绞股蓝FPS基因的3′RACE引物,采用3'RACE和5'RACE法克隆绞股蓝FPS基因全长cDNA。结果:获得绞股蓝FPS基因全长cDNA序列共1288个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放读框,编码342个氨基酸残基,推断该蛋白的相对分子质量为3.94×104。NCBI Blast结果显示绞股蓝FPS基因编码蛋白的氨基酸序列与已知的植物FPS氨基酸序列的同源性为91%~74%,核酸序列的同源性为88%~78%。结论:克隆了绞股蓝FPS基因全长cDNA序列,为进一步研究绞股蓝FPS基因的表达及三萜皂苷合成通路关键酶分子的进化奠定了基础。     

油菜profilin基因的克隆和表达分析

profilin是高等植物中的一种与肌动蛋白结合的蛋白,采用RT-PCR技术克隆了油菜（Brassica napus L.cv.canadian tween)花粉中的一个369bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA与已报道的其他植物的profilin基因具有较高核酸序列同源性,与玉米（Zea maysL.)基因同源性为82%,拟南芥（Arabidopsis)基因同源性为85%,水稻（Oryza sativa L.)基因同源性为81%,烟草（Nicotiana tabacum L.)基因同源性为82%,结论5′RACE和3′RACE技术,获得了全长cDNA,其为672bp。该cDNA包含一个开放密码框。5′未翻译区和一个带有Poly(A)的3′区域。Northern杂交结果显示它主要在花粉和花药中表达。     

异色瓢虫过氧化氢酶(Catalase)的基因克隆及序列分析

【目的】克隆异色瓢虫Harmonia axyridis保护酶系中过氧化氢酶(Catalase,CAT)的全长cDNA序列,并分析该基因的基本特性。【方法】采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫中克隆到HaraxCAT基因的cDNA全序列(GenBank登录号KC991026),并采用生物信息学的相关方法进行了分析。【结果】HaraxCAT的cDNA序列全长1 781 bp,其包含110 bp的3′非编码区域和45 bp的5′非编码区域,可读框长1 626 bp,编码541个氨基酸。预测该基因编码蛋白的分子量为61.55 ku,理论等电点为8.33,包含3个糖基化位点,无信号肽序列和跨膜结构。并且该基因包含了一个长达18个氨基酸的潜在的活性位点序列FDRERIPERVVHAKGAGA和血红素配体信号序列RIFSYGDTH。同源比对不同昆虫的CAT蛋白序列,发现昆虫CAT非常保守,HaraxCAT与其他昆虫的同源性高达65%及以上,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,达75.25%;系统发育分析表明其与鞘翅目赤拟谷盗和白星金花龟Protaetia brevitarsis亲缘关系最近。【结论】获得异色瓢虫catalase基因的cDNA全长序列,证实昆虫CAT蛋白非常保守。