引物悬挂延伸PCR扩增白藜芦醇合酶cDNA

为了得到葡萄白藜芦醇合酶(RS)基因的cDNA,实验以葡萄叶片为材料,利用引物悬挂延伸PCR法,以葡萄总DNA为模板,先分别扩增得到编码白藜芦醇合酶的第一外显子和第二外显子的序列,再以这两个序列为模板,进行第二轮的PCR,得到大小与RS基因大小相同的片段,经PCR产物测序证明,两个外显子已经准确无误地拼接,此片段就是RS基因。     

长片段融合PCR在构建烟曲霉rho1基因回补株中的应用

目的融合PCR是一种常用的构建重组片段或重组质粒的手段,但长片段融合PCR的难度较大。文中将探讨长片段融合PCR过程中引物设计及扩增条件对产物的影响。方法以构建烟曲霉rho 1基因回补株为例,采用融合PCR的方法扩增重组片段(长达6.5 kb),在引物设计时引入不同大小的同源区,并设置不同的扩增体系。结果当设计引物的同源区为35 bp,选用具有高扩增效率、高保真性的DNA聚合酶,以及各片段在融合PCR反应体系中的浓度为15 ng/μL时,实现了长达6.5 kb的片段扩增并完成了烟曲霉rho 1回补株的构建。结论在合适的PCR引物设计、片段浓度配比及聚合酶条件下,长片段融合PCR在丝状真菌的基因敲除及回补株的构建中是一种非常有效的工具。     

人G6PD T279A和T279S两种突变子的体外构建

目的:构建葡萄糖6磷酸脱氢酶(Glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD)T279A和T279S两种突变子.方法:以Genbank No X03674为参考序列设计并合成引物、以含G6PD基因的质粒(Philip JMason博士惠赠)为模板,PCR扩增获得G6PD野生型基因片段,琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物,连接、转化构建克隆质粒pMD18T-G6PD;酶切pMD18T-G6PD质粒、电泳后回收目的基因片段,连接、转化构建含G6PD野生型基因的重组质粒pAL-G6PD;设计并合成含有突变序列的引物,以pAL-G6PD为模板,体外扩增获得G6PD835-海口(835A→G,T279A)和835-中国-1(835 A→T,T279S)突变子.结果:酶切后经电泳鉴定表明获得与预期大小相符的pMD18T-G6PD质粒,EcoRI和Hind Ⅲ双酶切获得与预期大小相符的pAL-G6PD,测序结果与参考序列完全一致.0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,并定量pAL-G6PD单链DNA浓度约为200ng/uL.经测序鉴定并与参考序列比对结果表明获得了G6PD的T279A和T279S两种突变子.结论:成功构建了G6PD的T279A和T279S两种突变子,为下一步原核表达、生化性质以及酶动力学等研究奠定了基础.     

马铃薯gbss、ssⅡ和ss Ⅲ基因片段的融合及其RNAi载体的构建

颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）与可溶性淀粉合成酶（SSS）是淀粉合成的关键酶,其活性大小直接影响着淀粉的直链淀粉/支链淀粉比例、淀粉链长及结构等,进而影响着其品质。利用blast及分子生物学软件DNAStar对gbss、ssⅡ和ss Ⅲ基因的cDNA序列同源性进行分析比较,选用gbss的261bp（1～261）,ssⅢ的244bp（2164～2407）,ssⅡ的281bp（161～441）的cDNA片段,并应用重叠PCR法将其拼接成一融合基因gbs3s2,构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有"正向gbs3s2融合片段-pdk内含子-反向gbs3s2融合片段"ihRNAi的植物表达载体,为培育糊化温度低的马铃薯品系奠定基础。     

改造的HPV16型E7基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

分别以卡介苗(BCG)基因组DNA及宫颈癌组织提取DNA为模板,通过PCR扩增得到19kD抗原的胞壁区及其上游调控元件(19ss)基因序列和HPV16型E7基因序列。先将19ss基因与大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261重组,得到重组质粒pMCW。再将E7基因克隆至pMCW,得到重组质粒pMCW-E7。最后用PCR引物定点诱变法突变E7基因与转化有关的位点,得到重组质粒pMCW-mE7。对重组质粒pMCW-mE7用PCR扩增、双酶切及测序鉴定证实,19ss基因及突变的E7基因正确插入穿梭质粒pMV261。成功构建了重组穿梭质粒pMCW-mE7。     

结合单酶切位点的融合PCR技术对SCN1A基因的定点诱变

目的:利用结合单酶切位点的融合PCR技术对癫痫相关基因SCN1A进行定点突变。方法:首先设计两对引物PF1/PR1和PF2/PR2,PF1和PR2均位于突变位点最近的单酶切位点处,而突变位点设计在第一对反向引物(PR1)和第二对正向引物上(PF2)。通过重叠延伸法两次PCR扩增:第一次用PF1/PR1和PF2/PR2分开扩增,以扩增产物作模板,PF1/PR2作引物进行融合PCR,得到的扩增产物即含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pMD18-T载体,经测序筛选阳性克隆。结果:DNA测序表明SCN1A基因所编码的第946位密码子由精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His),再通过酶切和连接反应将重组质粒上的突变片段替换SCN1A表达质粒上的对应片段,成功构建了SCN1A突变载体。结论:与现在常用的长距离PCR定点诱导突变相比较,结合单酶切位点的融合PCR定点突变技术具备扩增距离短的优点,大大降低了自发突变的概率,适合于大肠杆菌中易自发突变的较大载体的定点诱变。     

汉坦病毒核壳蛋白重组抗原的制备和基因分型的研究

根据HFRSV汉滩型(HTN)代表株76-118和汉城型(SEO)代表株R22基因资料,设计了两组引物,用电脑软件分析证明设计符合引物标准.以一组引物克隆全长S基因片段和N端的部分S基因片段,并使它们在T7系统进行融合表达和非融合表达.非融合表达产量虽不及融合表达高,但生物活性好.以非融合表达的两个S基因片段产物作间接ELISA的包被抗原,其工作浓度均达1:10 000.用另一组引物建立了逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),检测我国不同地区由8种主要宿主分离的37个HFRSV毒株,2个阳性标准对照毒株和5个阴性对照标本,并与cELISA法比较,二者阳性检出率分别为100%和84.6%,符合率为84.6%,但前者比后者敏感性高15.4%.对其中20个毒株的PCR扩增产物先后用RsaⅠ和HindⅢ作二级酶切,建立了逆转录-聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(RT-PCR-RFLP)分型法.被定为HTN型的9株,SEO型的8株,余3株未能定型.此20个毒株曾用血清学方法分型,仅11株分型成功,与RT-PCR-RFLP法结果符合.分型成功率RT-PCR-RFLP法比血清法高30%.     

利用PCR对PVX外壳蛋白基因进行同义密码子修饰

利用聚合酶链式反应 (PolymeraseChainReaction ,PCR)与限制性内切酶相结合的方法 ,设计 4条含有限制性酶切位点和相应突变的引物。以马铃薯X病毒 (PotatoVirusX ,PVX)外壳蛋白cp基因为模板 ,扩增出相应的片段 ,相应酶切后通过三片段连接构建到克隆载体pBlueKS( / - )上。随机挑选重组子测序表明 ,利用三片段拼接成功地在PVX外壳蛋白基因的不同部位产生了突变。实验结果说明利用三片段接可以大大提高筛选得到突变子的效率 ,从而节省人力、物力和时间。     

大肠杆菌murB和birA基因的转录通读现象

在对应用限制性显示 PCR技术构建的大肠杆菌 poly(A)化mRNA的cDNA文库鉴定中 ,发现了一克隆的基因片段同时跨越了murB和birA基因的部分序列 ,提示这 2个基因存在转录通读现象 ,设计引物 ,利用逆转录后的产物为模板 ,进行了验证。结果表明murB和birA基因存在转录通读现象。     

禽网状内皮组织增生症病毒env基因的原核表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)SNV株的前病毒基因组cDNA序列,设计并合成1对引物,以SNV株前病毒cDNA全基因组克隆为模板,通过PCR技术扩增出该病毒囊膜糖蛋白env基因部分片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的下游,将重组质粒转化进宿主菌BL21中,在1.0mmol/LIPTG(37℃)诱导下,env基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,确定其表达的融合蛋白相对分子质量为72kD,并经Western-blot检测,发现在72kd目标条带处呈现一棕红色印迹。