日本血吸虫期别差异表达基因文库的构建及分析

为从期别差异表达基因分析入手研究血吸虫的生长发育机制,应用抑制性消减杂交 (suppressed subtractive hybridization , SSH) 技术首次构建了日本血吸虫尾蚴、虫卵和成虫的期别差异表达基因文库 . 经消减效率分析和三种文库克隆的 EST 的期别差异性鉴定,表明所建文库质量较高,为在整个基因组水平分离血吸虫的差异表达基因提供了重要材料 . 由三个文库选择 257 个插入片段大于 500 bp 的克隆测定了 EST 序列 . 同源性分析结果表明 257 个 EST 代表 182 种血吸虫基因,其中有 22 种为血吸虫已知基因,有 128 种为血吸虫已知 EST ,有 32 种为新发现的血吸虫基因 . 对 EST 编码蛋白的功能预测结果显示：尾蚴消减文库的基因多与运动、能量代谢、转录调节及致病性相关;虫卵消减文库的基因可能参与信号转导、细胞粘附、蛋白质和碳水化合物的代谢以及抗氧化反应;成虫消减文库的基因多参与蛋白质的合成、转运及分解代谢,参与虫体的运动等 . 大规模分离、分析血吸虫期别差异表达基因将对从分子水平去解读血吸虫的生长发育机制,筛选高效疫苗候选抗原、药物靶标及诊断制剂有重要意义 .     

运用于原核生物表达谱的研究技术

越来越多基因组序列的公布，掀起了功能基因组学研究的热潮。新的表达谱研究技术也不断涌现和发展。它们包括：差异显示PCR技术（Differential display PCR，DD-PCR）；基因表达指纹分析（gene ex—pression fingerprinting，GEF）；抑制性消减杂交技术（Suppression subtractive hybridization，SSH）和代表性差示分析（Representational difference analysis，RDA）；体内表达技术（In vivo expression technology，IVET）；     

黄瓜芽黄突变体抑制消减杂交文库的构建及初步分析

利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)分离了黄瓜芽黄突变体及其野生型之间差异表达的cDNA片段.以突变体和野生型分别作检测子和驱赶子,建立正向和反向两个消减杂交cDNA文库;经阳性克隆鉴定,在正向文库中获得特异表达的阳性克隆有133个,在反向文库中得到的阳性克隆有73个.测序后将所得到的159条非重复且非黄瓜的ESTs(登录号:GH270133～GH270291)进行序列同源性比对分析,发现这些ESTs分别与叶绿素合成、光合系统、信号转导、转录因子、氨基酸代谢、糖类代谢、脂类代谢等相关酶及蛋白基因高度同源.     

筛选冠突伪尾柱虫有小核细胞系和无小核细胞系饥饿期差异表达的ESTs

利用显微切割的方法建立大型腹毛目纤毛虫———冠突伪尾柱虫(Pseudourostyla cristata)的无小核细胞系,分别提取有小核和无小核细胞系的总RNA,用SMART-PCR方法直接合成dscDNA,进而运用抑制性消减杂交技术(Sup-pression subtractive hybridization,SSH)对冠突伪尾柱虫去小核前后的差异表达基因进行研究,构建了有与无小核细胞系在饥饿期差异表达基因的消减文库,随机挑取了284个克隆,应用cDNA阵列技术鉴定阳性克隆。将鉴定出的17个阳性克隆进行Blastx分析,结果表明17个EST(Expressed sequence tag)均可能与小核体功能密切相关,此为进一步阐明小核的遗传机理奠定了基础。     

植入前期与分娩前期子宫差别表达基因筛选及表达

采用抑制消减杂交技术 (suppression subtractive hybridization , SSH) ,以 SD 大鼠为实验材料,选取妊娠过程中植入前期 ( 第 5 天, D5) 和分娩前期 ( 第 19 天, D19) 子宫分别作为驱动方 (driver) 和实验方 (tester) ,进行抑制消减杂交,获得的消减文库经差异筛选得到 70 个阳性克隆 . 序列测定和同源对比分析表明,这些克隆所代表的基因在大鼠基因库中分别与 8 个已知基因有 90 ％～ 100 ％不等的同源性 . 这些基因均差别表达于分娩前期子宫组织中,其中首次发现尿鸟苷蛋白和干扰素诱导蛋白 16 在 SD 大鼠妊娠子宫中有表达 . RT-PCR 及半定量分析显示,尿鸟苷蛋白基因在妊娠第 19 天子宫中的表达显著高于妊娠第 5 天 (P < 0.001) ,而干扰素诱导蛋白 16 差异表达不明显 . 在妊娠 D6 、 D9 和 D12 的子宫中尿鸟苷蛋白基因自胚泡植入后其表达逐渐上升,妊娠 D15 下降,在妊娠 D19 表达量最高 . 结果提示特异表达的尿鸟苷蛋白基因可能与分娩有关 .     

弓形虫ZS2和RH株基因差异表达的研究

从RH和ZS2株弓形虫抽提纯化mRNA,经反转录后获得的双链cDNA分别作为driver和tester,采用抑制消减杂交技术(suppression substraction hybridization,SSH)技术扩增ZS2株中差异表达的基因。电泳图谱显示消减的cDNA与未消减的cDNA PCR扩增产物存在明显的差异,说明ZS2和RH株弓形虫转录水平存在着差异。     

利用SSH方法筛选与鉴定AC3基因缺失小鼠主要嗅觉表皮内的差异表达基因

腺苷酸环化酶3(Adenylate cyclase 3,AC3)基因在小鼠主要嗅觉表皮(Main olfactory epithelium,MOE)内的嗅觉信号传导中起着重要作用,AC3缺失是否会导致MOE内与之相关的基因发生差异表达,尚待确定。文章利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)方法,以AC3敲除(AC3-/-)及其同窝出生的野生型(AC3+/+)小鼠MOE为材料,构建了正向和反向两个消减文库,采用斑点杂交对消减文库进行初步筛选,对筛选出的差异表达基因进行序列测定及生物信息学分析,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行验证。斑点杂交筛选获得了386个差异表达克隆,随机选取其中的80个进行DNA序列测定,经序列比对后发现有62个在GenBank上获得了与之相匹配的基因信息,其中24个上调差异表达克隆对应于kcnk3、mapk7、megf11等基因,38个下调差异表达克隆对应于tmem88b、c-mip、skp1a、mlycd等基因。利用Gene Ontology(GO)方法对这些差异表达基因进行蛋白功能注释,发现它们主要集中在分子结合、细胞周期、生物和细胞过程等功能方面。选取其中上调基因kcnk3和下调基因c-mip、mlycd、tmem88b及trappc5进行qRT-PCR验证。结果表明,在AC3-/-小鼠MOE内kcnk3的表达量显著上调,是对照组小鼠的1.27倍,而c-mip、mlycd、tmem88b和trappc5的表达量显著下调,为对照组小鼠的20%、7%、32%和29%。这些基因的功能与K+通道、细胞发育与分化、脂肪代谢和膜蛋白转运等密切相关。推测它们可能与AC3基因共同作用,调节小鼠MOE内的嗅觉信号传导信息。     

巴西橡胶树顺式异戊烯基转移酶基因cDNA克隆及其序列特征分析

以巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳的RNA为Tester;叶片RNA为Driver,利用抑制消减杂交法(suppressive subtractive hybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库.通过反式Northern点杂交(reverse Northern dot blots)筛选到一个与顺式异戊烯基转移酶基因(橡胶生物合成的关键酶基因)高度同源的阳性克隆R363.采用RACE方法获得该克隆的全长cDNA(GenBank登陆号:AY461414).序列分析表明,该基因长1156 bp,含有873 bp的阅读框,编码290个氨基酸,分子量约为32.9 kD,等电点为7.2,含有N-端跨膜螺旋区.同源性分析表明R363编码的蛋白质具有异戊烯基转移酶家族的特征,含有cis-异戊烯基链转移酶的5个高度保守区,推测R363可能是一种新的顺式-异戊烯基转移酶基因.Northern blot分析显示,R363在胶乳中高度表达,在叶中不表达.乙烯处理前后表达强度一致,表明该基因表达不为乙烯所诱导.     

抑制性消减杂交技术的应用

基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容.在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH)技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中.近年来,抑制性消减杂交(SSH)技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展.主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述.     

分离差异表达基因的方法

了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况,可以为研究生命活动过程提供重要信息。以差别筛选,扣除杂交等基本方法为出发点,研究基因表达差异的方法不断完善,先后出现了DDRT-PCR,RDA,SSH,cDNA微阵列(基因芯片)等技术。这里着重对这些方法的优缺点及改进进行了论述和评介,并对技术的发展趋势进行了分析。     

筛选差异表达基因方法的新进展

了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况,可以为研究生命活动过程提供重要信息。以差别筛选、削减杂交等基本方法为出发点,研究基因表达差异的方法不断完善,先后出现了DDRT—PCR、RDA、SSH、cDNA微阵列(基因芯片)、基因表达的系统分析(SAGE)等技术。本着重对这些方法的优缺点及改进进行论述和评介,并对技术的发展趋势进行了分析。     

差异表达基因的分离策略

生命活动的各个进程伴随着不同基因的选择性开启和关闭。如何有效地分离克隆各种差异表达的基因,成为分子生物学研究的一个努力方向,大量差异基因分离策略因之问世。本文扼要介绍了近年来发展的几种主要分离策略,并详细介绍一种新的差异基因分离方法——抑制差减杂交。     

筛选差别表达基因的方法及其应用新进展

筛选差别表达基因是进行生物个体生长、发育调控和病理等研究工作的关键步骤之一,对基因组学、蛋白质组学以及更深层次的生命科学研究都具有重要意义。目前,筛选差别表达基因常用的方法主要有DDRT-PCR、SSH、SAGE和基因芯片等方法。本文就这些方法最新的应用进展进行了综述,并重点介绍了近年问世的Megaclone、Megasort和MPSS等新方法。     

mRNA差异显示

分离差异表达的基因是研究生命调节过程的重要手段,mRNA差异显示技术是一种能成功分离差异表达基因的方法,文章对该方法的基本原理、方法步骤及其应用作了较为详细的介绍。     

鼻咽癌上皮细胞株HNE1差异表达基因的分离与鉴定

为了分离鼻咽癌差异表达基因 ,应用抑制性扣除杂交技术 ,在正向抑制性扣除杂交中 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为检测子 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为驱赶子 ;在反向抑制性扣除杂交中 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为检测子 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为驱赶子 ,分别通过抑制性扣除杂交 ,构建了鼻咽癌上皮细胞株HNE1表达下调和表达上调的两个扣除cDNA文库 .从鼻咽癌相关的扣除cDNA文库中随机挑取 1 2 0 0个克隆 ,采用菌落PCR扩增其插入cDNA片段 ,自动点膜制备成cDNA微阵列膜 ,分别用鼻咽癌上皮细胞株HNE1、人胚鼻咽上皮mRNA经逆转录标记cDNA探针 ,分别与cDNA微阵列膜杂交 ,通过杂交信号的自动扫描分析 ,对杂交信号存在 5倍差异的克隆进行测序 ,获得了 1 0个鼻咽癌差异表达基因的cDNA片段 ,其中 3个为新基因序列 ,其GenBank登录号为 :AF5 1 0 1 88、AF5 1 0 1 89和AF5 1 0 1 90 ,7个代表已知基因序列 .采用RT PCR证实S1 0 0A8,CK1 9和RBP1基因在人胚鼻咽上皮中高表达而在鼻咽癌细胞株HNE1中低表达 .这些结果显示上述基因可能是鼻咽癌发生的重要因素     

转化的大鼠胚胎成纤维细胞系差异表达基因的筛选研究

来源于转化的大鼠胚胎成纤维细胞系的两株细胞,A1－5细胞与B4细胞相比表现出非常强的抗辐射性并伴随不同寻常强的G2延迟效应;用PCR选择性抑制消减杂交方法对这两株细胞进行差减,希望找到对A1－5细胞表现出的不同寻常的表型起关键作用的某一个或某一些基因。结果得到了160个差减转化子,逐个进行序列测定,并进行Dot blot杂交,共得到35个差异表达基因片段（EST）。通过对美国国家生物技术信息中心（NCBI）的非冗余序列库（NT）、鼠EST库及人EST库的BLAST进行同源检索,发现其中21个代表了尚未登录的新基因,另外14个分别与已知基因高度同源。