结核分枝杆菌抗原特异反应性白细胞介素-22对结核性和恶性胸腔积液的鉴别诊断价值

目的:研究结核性胸膜炎与恶性胸水患者胸腔积液单个核细胞经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后IL-22的表达特点,探索IL-22对结核性胸膜炎和恶性胸水的鉴别诊断价值。方法:采用eBioscience IL-22和IFN-γ试剂盒,利用流式细胞术微球阵列法检测52例结核性胸膜炎和35例恶性胸水患者胸水上清、PFMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激培养后上清中IL-22和IFN-γ的浓度,并作统计学分析。结果:结核性胸膜炎组IL-22在刺激后上清中表达水平显著升高,且显著高于恶性胸水组(P0.05)。结核性胸膜炎组IL-22与IFN-γ在刺激后上清中表达水平显著相关(r=0.3485,P=0.0320)。结论:结核分枝杆菌抗原特异反应性IL-22可作为鉴别诊断胸腔积液病因的新指标。     

应用多重PCR方法检测石蜡包埋组织标本中的分枝杆菌DNA

应用多重PCR方法检测并鉴别石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌复合体与非结核分枝杆菌DNA扩增片段类型 ,为结核分枝杆菌复合体感染与非结核分枝杆菌感染的病理学诊断提供一种补充的鉴别诊断方法。应用三对具有特异性的寡核苷酸引物 ,进行多重PCR扩增。这三对引物分别对应于分枝杆菌 6 5kD表面抗原、结核分枝杆菌插入序列IS6 1 1 0及人类β 珠蛋白基因的部分序列 ,其扩增产物分别为 3 83bp、1 2 3bp和 2 6 8bp。此种多重PCR方法检测的灵敏度为 0 6pg。经多重PCR扩增后进行凝胶电泳 ,结核分枝杆菌复合体 (结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、BCG)均可见 3 83bp、1 2 3bp片段 ,而非结核分枝杆菌 (鸟、龟、瘰疬、蟾蜍、堪萨斯、胞内、耻垢分枝杆菌 )仅见 3 83bp片段 (猿猴分枝杆菌与结核分枝杆菌复合体相同 )。与上述相比 ,分枝杆菌感染的临床标本分别增加了一条 2 6 8bp片段。对 2 0 9例临床初步诊断为淋巴结结核病人的石蜡包埋组织标本进行了多重PCR检测 ,1 93例病理诊断为淋巴结结核、结核性肉芽组织、结核性肉芽肿性炎症病人的标本 ,检测结果符合结核分枝杆菌复合体感…     

猕猴结核分枝杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立猕猴结核分枝杆菌PCR快速检测方法。方法根据GenBank中报道的人型结核分枝杆菌标准株H37RV全基因序列,针对其中致病性结核分枝杆菌所特有的保守区域ESAT-6设计一对引物进行TouchdownPCR反应,利用此方法对100份野生来源猕猴全血标本进行检测,并与传统的PPD实验和咽拭子抗酸染色实验结果作比对。结果抽取33份野生来源猕猴的外周血,提取DNA进行扩增,扩增片段经纯化、回收克隆测序后用BLAST软件进行同源性对比,与GenBank中报道的序列基本相同,检测标本中有4份（4／33）为阳性,其中3份（3／33）标本与结核菌素试验和咽拭子抗酸染色试验结果相符合。结论建立了从猴全血中直接检测猴结核分枝杆菌DNA的TouchdownPCR方法,具有敏感性和特异性高,且简便的优点。     

应用专一性寡核苷酸微阵列可靠地检测结核分枝杆菌利福平耐药性

DNA微阵列代表聚合酶链反应产物诊断测序的发展方向 .根据结核分枝杆菌rpoB基因利福平抗药性决定区域内点突变及其它重排的特征 .研制一种快速地鉴定结核分枝杆菌利福平耐药菌株的中等密度微阵列方法 .利福平抗药性通过使荧光标记扩增遗传物质与微阵列杂交测定 .检测5 3株利福平耐药结核分枝杆菌和 15株利福平敏感结核分枝杆菌 .微阵列方法的检测结果与药物敏感性试验和DNA测序结果完全一致 .临床标本PCR扩增后仅 1 5h可检出利福平耐药临床分离株 .表明寡核苷酸微阵列是高效的、专一性的方法 ,可作为检测利福平抗药性的快速方法以弥补传统培养方法的不足     

人结核分枝杆菌特异性核酸探针制备及结核病PCR检测技术的初步临床应用

采用人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis TB)染色体DNA为模板,选择位于插入片段IS6110中884～865和568～588碱基对处的两个片段为引物,扩增出317bp的特异性片段．将其克隆进pUCl9载体。酶切图谱分析和DNA序列测定证实为目的片段。该片段经DIG标记,分别与11种分枝杆菌DNA进行Southern杂交,结果证明只与人型复合分枝杆菌发生杂交反应。利用该对引物建立的PcR检测拄术对74份结核病痰液标本进行检测,并与临床细菌快速培养结果相比较,发现48份临床阳性均为PcR阳性,在26份临床阴性标本中亦发现11份PCR检测阳性。将标本PCR产物与克隆探针进行杂交,显示两者结果完全一致。说明PCR检测体系结果可靠,其灵敏度明显高于目前临床所采用的方法,可作为一种常规技术用于结核病的临床检测。     

荧光定量PCR诊断结核性脑膜炎的临床价值

目的 探讨荧光定量PCR检测脑脊液（CSF）结核分枝杆菌评估其临床意义。方法 应用荧光定量PCR技术检测45例CSF结核分枝杆菌并与抗酸杆菌染色。结核抗体酶联免疫吸附试验（结核抗体ELISA,简称酶联OT）进行比较。结果 荧光定量检测CSF结核杆菌的阳性率为11．1％,酶联OT为13．3％,抗酸杆菌染色为0％。结论 荧光定量PCR用于检测CSF结核分枝杆菌不具有灵敏度,阳性率低,对临床诊断结核性脑膜炎（简称结脑）无多少价值,不值得在临床上推广应用,必须寻找更有价值的诊断方法。     

新型Taq Man-MGB探针在结核分枝杆菌实时PCR检测中的应用

为建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的结核分枝杆菌DNA定性定量检测方法 ,以TaqMan探针技术为基础 ,运用TaqMan MGB探针 ,实时检测临床标本中的结核分枝杆菌DNA .用来自临床标本的DNA及克隆于载体的IS6 1 1 0序列检测所建立方法的有效性 .结果显示 ,所建立方法的最低检测限度为 1个基因拷贝 反应 ,在每反应 1 0 0 ～ 1 0 8拷贝范围内 ,Ct 值同DNA量的对数呈线性关系 .同一模板不同时间或同一时间不同管内扩增 ,所得Ct 值恒定 .用该方法检测 37例结核分枝杆菌培养阳性的痰液标本 ,敏感度为 1 0 0 % ;用该方法检测 1 6例TB系列阴性参考品 ,特异性为1 0 0 % .结果表明 ,所建立的方法是用于结核分枝杆菌定性定量检测较理想的方法     

建立PCR-CE-RFLP方法快速诊断女性生殖道的细菌感染

目的建立PCR-CE-RFLP方法直接检测女性生殖道感染标本中的细菌,为临床提供快速、准确的诊断依据。方法利用细菌16SrRNA集保守性和变异性于一体的特点,合成1对通用引物,其上游5’端用5＇-FAM标记。将8株已知菌和38例临床诊断为生殖道炎症的标本及其培养物进行PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶HaeⅢ消化,经毛细管电泳（CE）通过限制性片断长度多态性分析（RFLP）来鉴定不同病原菌。结果（1）已知菌株PCR扩增阳性率为75％（6／8）、生殖道感染标本的PCR扩增阳性率为79％（30／38）,毛细管电泳阳性率两者均为100％。（2）已知菌株PER扩增产物的5’端HaeⅢ完全酶切片段的毛细管电泳结果,与电子克隆产物的酶切片段基本一致。（3）用传统培养检测法在生殖道能检出的常见致病菌,实验用PCR-CE-RFLP法同样也能检出。（4）实验还发现数种传统培养法未检出的细菌。结论PCR-CE-RFLP法比传统的细菌培养法具有快速、准确、灵敏的优点,比传统方法缩短20h,可用于临床标本的直接鉴定。     

腺苷脱氨酶和结核抗体检测在结核性胸水诊断中的价值

目的 寻找对结核性胸水高敏感、高特异性而又简单的检查方法。方法 采用比色法和ELISA法对50例结核性胸水腺苷脱氨酶（ADA）和结核抗体水平进行了检测,并以45例恶性胸水和30例右心功能不全引起的胸水作对照。结果 结核性胸水ADA和结核抗体水平显著高于对照组（P<0.01）。以ADA>45U/L作为阳性标准,其对结核性胸水的敏感性为100%,特异性为98.6%,准确性为99.2%;结核抗体对结核性胸水的敏感性为90%,特异性为93.3%,准确性为92%。 结论 ADA 和结核抗体对诊断结核性胸水均有重要价值。在使用抗结核药特别是在并用激素治疗后,胸水ADA及结核抗体水平会随之下降,故应在停药1周后检测并动态观察二者的变化     

重组酶聚合酶扩增技术检测结核分枝杆菌

目的利用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术检测结核分支杆菌。方法采用Axxin T8-ISO扩增仪(TwistDX公司),反应温度设置为39℃,反应时间20min。检测分为实验组、阳性对照组和空白对照组。实验组模板DNA从痰液中提取。阳性对照模板DNA为H37Rv标准菌株样本DNA及卡介苗提取的DNA。空白对照为蒸馏水。结果 RPA技术可在20min内明显区分103～106 copies/mL的阳性质粒与阴性对照。对分离培养的结核杆菌(H37Rv)DNA及卡介苗提取的DNA,阳性克隆质粒进行等温扩增,结果结核杆菌分离株DNA、卡介苗DNA、阳性克隆质粒均有阳性扩增反应,而非结核分枝杆菌分离株和阴性对照无阳性扩增反应。灵敏度为100%,特异性为82%。结论 RPA技术利用了重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶代替了传统PCR变性、退火、延伸的热循环过程,在常温25℃～42℃、15～30min内即可实现痕量核酸的快速扩增,可应用于快速检测人结核分枝杆菌,是一种全新的检测方法。