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相似文献
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1.
肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的致病菌,加深其致病机理的基础研究将为相关疫苗研究及疾病控制等提供新的思路和依据.串联亲和纯化(TAP)技术是最近发展的分离纯化天然状态蛋白质复合物进而研究蛋白质相互作用的新方法.用我们自己构建的原核表达串联亲和标签载体,在大肠杆菌O157∶H7中表达了标签融合蛋白GroEL-TAP,建立了非变性条件下制备蛋白复合物的方法,并且对串联亲和纯化过程中的相关实验条件进行了探索和优化,最终得到了高纯度的GroEL-TAP与天然GroEL形成的嵌合型多聚体复合物.这表明我们建立的串联亲和纯化技术能高度特异地纯化靶蛋白参与形成的复合物,为后续寻找O157∶H7中毒力蛋白参与形成的复合物奠定了实验基础.  相似文献   

2.
质谱技术高速发展,检测灵敏度不断提高,但区分特异性与非特异性相互作用仍然是研究相互作用蛋白的瓶颈,获得高纯度的蛋白复合体是鉴定相互作用蛋白的限制性因素。近年来串联亲和纯化(TAP)技术的产生和发展有效解决了相互作用蛋白鉴定中的特异性问题。TAP技术是将N端或C端TAP标签与目的蛋白融合并导入靶细胞进行表达,裂解细胞释放融合蛋白,在接近生理状态下利用标签两步特异性亲和洗脱得到蛋白复合体。其中,TAP标签蛋白的选择和优化是该技术成功的关键。  相似文献   

3.
亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用   总被引:1,自引:0,他引:1  
亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介绍了亲和标签的组合使用策略,His6-MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。  相似文献   

4.
串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术,经过两步特异性亲和纯化,可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质。TAP方法最初用于酵母中,因其具通用性、高效性、高纯度及假阳性低等特点得到了快速发展,至今已成功运用于许多其他生物。现主要介绍TAP方法的原理、TAP标签及其在不同物种中的应用。  相似文献   

5.
《生命科学研究》2016,(1):16-20
建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。  相似文献   

6.
重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色.亲和纯化作为最为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用.由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异.应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签.近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法.多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述.  相似文献   

7.
RNA结合蛋白在RNA的生成与代谢中发挥着重要作用.我们在近年报道的PAR-CLIP(photoactivatableribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation)技术的基础上建立了一套快速、有效鉴定RNA结合蛋白的实验方法:以串联亲和纯化替代一步免疫沉淀获得高纯度蛋白-RNA复合物;将Sypro Ruby蛋白染色与RNA放射自显影相结合判断复合物中哪种或哪些组分为RNA结合蛋白,该方法命名为紫外交联合并的串联亲和纯化(cross-linkingand tandem affinity purification,CLiTAP).运用该方法对布氏锥虫的三种锌指蛋白ZC3H7、ZC3H34和ZC3H5进行分析,发现ZC3H7作为帽结合蛋白复合物的核心组分具有很强的RNA结合能力;ZC3H34结合RNA能力较弱,但其互作蛋白具有强的RNA结合活性;相比之下,ZC3H5及其复合物组分皆无RNA结合活性.这些结果表明,CLiTAP与蛋白质鉴定方法相结合,能够有效鉴定靶蛋白复合物中的RNA结合蛋白种类,也为进一步定位RNA结合位点、研究RNA结合蛋白的结构及作用机制奠定了基础.  相似文献   

8.
【目的】构建串联亲和纯化原核表达载体,用于研究细菌中(生理状态或接近生理条件下的)蛋白-蛋白相互作用。【方法】设计并合成两条串联亲和标签序列,分别可以在靶蛋白N端和C端融合Protein G和链亲和素结合肽(Streptavidin binding peptide,SBP)标签;以pUC18载体为骨架,去除原有的阻遏蛋白基因,构建组成型表达载体pNTAP和pCTAP。【结果】成功构建N端和C端标签表达载体pNTAP和pCTAP,它们在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、肠出血性大肠杆菌O157:H7和痢疾杆菌福氏5型M90T菌株中都可以实现表达。【结论】本实验构建的两个串联亲和纯化表达载体可以在部分革兰氏阴性细菌中表达,为研究细菌内蛋白-蛋白相互作用及致病菌毒力蛋白的作用机制奠定了基础。  相似文献   

9.
韩月雯  吴瑞  马超锋  李园园 《病毒学报》2021,37(5):1074-1078
风疹病毒(Rubella virus,RV)的衣壳蛋白(Capsid protein,CP)不仅是病毒颗粒的重要组成部分,而且还可以通过与宿主蛋白之间的相互作用来调控病毒的转录和复制.为了系统研究衣壳蛋白与宿主蛋白之间的相互作用关系,我们从RV基因组中克隆获得衣壳蛋白基因序列,将该序列导入含有eXact-6His串联亲和纯化标签的慢病毒表达载体中,并构建了稳定表达eXact-6His-Capsid融合蛋白的293T细胞系.通过eXact和6His标签的两次亲和纯化获得衣壳蛋白相互作用蛋白复合物,质谱检测并筛选后发现22个可能与衣壳蛋白相互作用的宿主蛋白.随后构建衣壳蛋白的相互作用网络并进行功能学分析,发现其相互作用蛋白主要参与病毒感染、RNA剪切、细胞凋亡及酶相关通路等过程.  相似文献   

10.
目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。  相似文献   

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