少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

Δ^6-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ^6-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ^6-肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因（RAD6）亚克隆到表达载体pPIC3．5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱-质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16：1、C17：1、C18：1、亚油酸和α-亚麻酸在△6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因的功能。     

少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16∶1、C17∶1、C18∶1、亚油酸和α-亚麻酸在Δ⁶和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的功能。     

少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

△6-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶.在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码△6-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的△6-脂肪酸脱氢酶基因.把少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达.提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱-质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16:1、C17:1、C18:1、亚油酸和α-亚麻酸在△6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性.此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平.综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析△6-脂肪酸脱氢酶基因的功能.     

Δ^6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好

添加α-亚麻酸作为底物,经半乳糖诱导,在含有少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成;同时添加亚油酸和α-亚麻酸时,检测到γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,而且十八碳四烯酸的含量是γ-亚麻酸含量的3．81倍,表明在酿酒酵母中少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶不仅能催化α-亚麻酸生成十八碳四烯酸,而且偏好n-3途径中的底物α-亚麻酸。同样,在改变少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有明显提高。     

莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达与活性分析

采用RT-PCR方法克隆到莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因lyd(l)5,与毕赤酵母表达载体pPIC3.5K连接,电击法转化毕赤酵母GS115.转化子经高浓度G418筛选出高抗性重组子,经PCR鉴定目的基因已整合入毕赤酵母基因组中.甲醇诱导表达,RT-PCR检测表明莱茵表藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中得到了表达;毕赤酵母总脂肪酸甲酯经气相色谱(GC)分析结果显示亚油酸的含量明显降低,而α-亚麻酸的含量有所提高.     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸（GLA）作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3.5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱质谱（GC-MS）联用分析表明高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16.26%。     

Δ~6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好

添加α 亚麻酸作为底物 ,经半乳糖诱导 ,在含有少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成 ;同时添加亚油酸和α 亚麻酸时 ,检测到γ 亚麻酸和十八碳四烯酸生成 ,而且十八碳四烯酸的含量是γ 亚麻酸含量的 3 81倍 ,表明在酿酒酵母中少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶不仅能催化α 亚麻酸生成十八碳四烯酸 ,而且偏好n 3途径中的底物α 亚麻酸。同样 ,在改变少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母中 ,也得到类似的结果 ,而且各种目的脂肪酸的含量均有明显提高     

雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌Δ6-脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉(Thamnidium elegans)As3.2806Δ6-脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)向两端延伸得到1504bp的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSc1的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSc1中异源表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸(GLA)的含量占酵母总脂肪酸的7.5%。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(GenBank,AY941161)。     

Δ6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好*

添加α 亚麻酸作为底物 ,经半乳糖诱导 ,在含有少根根霉Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成 ;同时添加亚油酸和α-亚麻酸时 ,检测到γ 亚麻酸和十八碳四烯酸生成 ,而且十八碳四烯酸的含量是γ 亚麻酸含量的3.81倍 ,表明在酿酒酵母中少根根霉Δ⁶-脂肪酸脱氢酶不仅能催化α-亚麻酸生成十八碳四烯酸 ,而且偏好n 3途径中的底物α 亚麻酸。同样 ,在改变少根根霉Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构     

△6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好

添加α-亚麻酸作为底物,经半乳糖诱导,在含有少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成;同时添加亚油酸和α-亚麻酸时,检测到γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,而且十八碳四烯酸的含量是γ-亚麻酸含量的3.81倍,表明在酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶不仅能催化α-亚麻酸生成十八碳四烯酸,而且偏好n-3途径中的底物α-亚麻酸.同样,在改变少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有明显提高.