广州2006年乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因特性分析

为了解2006年广州地区流行的乙型流感病毒株血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的基因特性,选择病原学监测病毒株和暴发性疫情病毒株,提取病毒RNA并逆转录为cDNA,通过PCR方法扩增乙型流感病毒HA和NA全长基因,将扩增的DNA片段接入T-A克隆载体进行测序,并使用DNAStar软件对测序结果进行分析。结果显示:不同来源的流感病毒株HA的同源性为99%以上,都属于Victoria系;不同来源的病毒株NA同源性为98%以上。HA和NA的种系发生树分析表明:病原学监测毒株同源性更接近,而暴发性疫情毒株的同源性则相对较为分散。所有毒株与WHO推荐的2005~2006年度疫苗株B/Shanghai/361/2002的同源性只有88.9%~89.7%,说明该年度的流感疫苗对乙型流感不能提供最佳的保护。     

2021-2022年嘉兴市乙型流感病毒序列进化分析

本研究分析了嘉兴市2021-2022年乙型流感病毒基因进化特征。首先采集2021-2022年嘉兴市流感样病例咽拭子标本进行流感病毒核酸检测、病毒分离。然后从嘉兴市2021-2022年流感分离株中共选取27株乙型流感病毒代表毒株进行全基因组高通量测序。最后利用生物信息学软件从核苷酸、氨基酸及分子层面对流感毒株进行分子特征分析。2021年嘉兴市共检测1362例流感样病例标本,阳性标本数98例,阳性率为7.20%,均为乙型流感病毒Victoria系（Influenza B virus Lineage Victoria, BV）。2022年嘉兴市共检测1318例流感样病例标本,阳性标本数335例,其中BV系89例,阳性率为6.75%,H3N2亚型246例,阳性率为18.66%。与疫苗株相比,2021年血凝素（haemagglutinin,HA）核苷酸与氨基酸序列相似性为98.92%±0.24%、98.55%±0.21%,神经氨酸酶（neuraminidase,NA）核苷酸与氨基酸序列相似性为99.25%±0.13%、99.37%±0.22%;2022年HA核苷酸与氨基酸序列相似性为99.12%...     

在MDCK细胞上高产的乙型流行性感冒病毒株的筛选及其全基因组克隆

流行性感冒(流感)病毒可引起世界范围的大流行,因此需要及时地生产流感疫苗来预防流感的流行.乙型流感病毒是疫苗的重要组成部分.传统制备疫苗的方法是使用鸡胚生产,存在很多缺陷,应用哺乳动物细胞生产流感疫苗是个更好的选择.但是,乙型流感病毒感染MDCK细胞后,很难得到持续的高产.此实验筛选到的乙型流感病毒在MDCK细胞连续传代15代后,PFU值从第1代的8×104到第15代2×109,TCID50从第1代6.5到第15代的8.0.将筛选到的毒株进行全基因组克隆,用两套引物获得乙型流感病毒的全部8个节段.此结果为利用反向遗传技术将高产毒株与流行毒株重配,进而在哺乳动物细胞上生产基因工程流感疫苗打下基础.     

南京市2011年乙型流感血凝素基因分子特征分析

[目的]分析2011年南京市乙型流感病毒的血凝素(HA)分子学特征.[方法]选择7株2011年南京市不同时间段有代表性的乙型流感毒株进行HA基因序列测定,通过生物信息学方法对HA分子学特征进行分析.[结果]7株乙型流感毒株分为两个系,4株为Victoria,3株为Yamagata;与2011年度疫苗株相比,Victoria和Yamagata系毒株分别在抗原位点146、197和116、198发生了氨基酸替换;其中197和198位点分别是Victoria和Yamagata毒株的受体结合位点,由于上述位点的替换使得Victoria系/Yamagata系毒株分别在197/196位增加了一个潜在的糖基化位点.[结论]2011年南京市乙型流感Victoria 系和Yamagata系病毒同时存在,Victoria/Yamagata毒株197/198位点的氨基酸替换,值得做进一步的探讨.     

一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析

从广东省疑似流感发病猪分离到1株H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Guangdong/01/2005(H3N2)),对其各个基因进行克隆与测序,并与GenBank中收录的其它猪流感、禽流感和人流感的相关基因进行比较,结果表明,HA全基因与广东2003~2004年分离的H3N2猪流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上,与纽约90年代末分离的H3N2人流感毒株同源性在98.5%以上;NA基因与纽约1998~2000年分离的H3N2人流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上;NS基因、M基因的核苷酸序列与H1N1亚型猪流感毒株A/swine/HongKong/273/1994(H1N1)的核苷酸序列同源性较高,分别为97.9%、98.4%,与美洲A/swine/Iowa/17672/1988(H1N1)的核苷酸序列同源性分别为96.7%、97.1%;其他基因的核苷酸序列与H3N2人流感毒株具有很高的同源性。因此,推测其M和NS基因来源于H1N1亚型猪流感病毒,HA、NA及其他基因均来源于H3N2亚型人流感病毒。表明此H3N2亚型猪流感病毒为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒经基因重排而得到的重组病毒。     

20世纪以来流感在人群中的流行特征

自1918年西班牙流感爆发以来,流感病毒已经导致了五次人群中的大规模流行,除西班牙流感外,还有1957年由H2N2病毒引发的亚洲流感、1968年由H3N2病毒引发的香港流感、以及1977年的俄罗斯流感和2009年的墨西哥流感。而西班牙流感、俄罗斯流感和墨西哥流感三次流感的大流行均是由H1N1病毒毒株引起。此外,许多局部人群中的小规模流行与感染也被证实是流感病毒直接经人与人之间传播所导致。本文将主要对五次人流感的大规模爆发以及具有代表性的局部流行事件的流行病学特点以及病毒序列特征作一个小结。     

2019年不同类型流感病毒在佛山地区流行特征分析

2017-2018年间,流感病毒在我国流行态势严重,为探讨佛山地区流感病毒的流行特征,为佛山市流感的防控提供科学依据,本研究搜集2019年佛山市流感监测哨点医院采集的流感样病例标本,采用实时荧光RT-PCR检测流感病毒核酸,分析佛山市流感流行病学数据库病人详细信息,分析流行趋势及病毒流行的类型,为制定流感的防控提供科学依据.结果显示:2019年共检测流感样病例咽拭子标本1356例,流感病毒核酸检测阳性率为25.52％,甲型流感病毒阳性率为19.17％,乙型流感病毒阳性率为6.34％.不同职业人群共18个,小学生(7.67％),幼托儿童(3.17％)流感病毒核酸检测阳性率较高.把年龄分成5个年龄段进行分析,流感阳性率最高的是25～59岁组与5～14岁组.2019年佛山地区主要检出新甲H1型、季H3型、BV型三种型别,1月份,12月份为流感活跃的两个高峰,各型别在不同的时间交替或共同流行.不同性别的人群流感阳性率差异无统计学意义.不同型别病毒株在不同性别人群间阳性率差异无统计学意义.本研究结果提示佛山地区主要以甲型流感流行为主,优势亚型为新甲H1型,季H3型,部分乙型流感患者,以BV型为主.流感病毒感染的重点人群是小学生与幼托儿童,不同类型的流感病毒,在不同性别人群间感染无差异.通过对2019年佛山市流感流行特征的分析可以为佛山市流感的防控提供科学依据.     

2008～2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因特性分析

为了解2008~2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因变异情况,选择珠海市2008~2009年期间不同时间点的经狗肾传代细胞(MDCK)培养分离的H3N2亚型流感毒株20株,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增HA1基因片段,将产物纯化并测序,推导氨基酸序列,进行基因进化特性分析。与同时期的疫苗株比较,2008年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇的氨基酸位点变异数少于4个;2009年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株除09-0056外,HA1区存在5个位于抗原决定簇内的变异氨基酸位点。2008年H3N2亚型流感毒株的HA1区的糖基化位点与疫苗株一致;2009年H3N2亚型流感毒株HA1区丢失第144位糖基化位点。2008~2009年H3N2亚型流感毒株RBS氨基酸序列未见明显变异。与2008年H3N2亚型流感毒株比较,2009年H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇内存在多个位点的氨基酸替换。这些说明2008年珠海市流行的H3N2亚型流感病毒不是新变种;2009年流行的H3N2亚型流感病毒为新的变异株,这可能是H3N2亚型流感病毒在2009年6-9月为珠海地区季节性流感流行优势株的原因。     

关于1918流感病毒的两项新研究

在1918～1919年期间,“西班牙”(“Spanish”)流感造成全球约2千万至5千万人死亡.为了防止再发生如此致命的暴发流行,长期以来,科学家力求阐明“西班牙”流感毒株与其它比较良性的毒株有什么特征性差异.由于研究者缺乏该杀伤性病毒的活样本,故而不可能解决这个关键性问题.现在有两项新研究对1918流感毒株的特征作出了新的说明.其中一项新研究坚持了9年,完成了1918流感毒株全部基因序列的测定.研究者是从1918年“西班牙”流感暴发流行时的尸检中得来的样品以及从埋葬的另一名患者尸体得来的样品.1918流病毒样品因长期保存而发生降解,但仍保留可编码8个主要基因片段的RNA小片段.研究者用这些RNA片段测序了该病毒的5个基因片段.在2005年10月6日的Nature上,该研究组发表了最后3个序列.这3个序列中的基因编码1918流感病毒聚合酶(1918 flu’s polymerases),该聚合酶对动物体宿主中的病毒复制至关重要.研究者发现,在1918流感病毒与现代禽流感(modern bird-flu)病毒之间有明显的相似性,包括目前正在东南亚流行的致命性禽流感病毒株H5N1.这些结果更加证明1918流感源自禽流感病毒,禽流感病毒获得了感染人类的能力.研究者指出弄清楚1918流感病毒适应人类宿主的机制,便可帮助研究者防止现代禽流感在人类的暴发流行.如果我们能够鉴定出该病毒的部分基因组对适应性是重要的,我们便能在病毒刚开始表现对人类的适应性时,提供监督检查.另一项新研究,用刚完成的测序,已部分重建了1918流感病毒.研究者根据病毒的基因密码合成了RNA的8个主要片段,然后他们将这8个片段RNA与相关流感病毒的RNA小片段联结起来,这个小片段RNA的遗传物质使动物细胞能阅读病毒基因.在生物安全水平下,即在对生物危害保护的第二个高峰水平下,研究者发现,重建的病毒在3～5天内,杀死了其他健康的小鼠,它对鸡蛋内鸡胚胎的发育也是致命的,这便支持1918流感病毒很可能来源于禽流感病毒的推断.当用该重建病毒感染人肺细胞时,病毒易于复制.将1918流感病毒基因与当代流感毒株相混和并配对时,研究者发现,1918流感病毒的聚合酶基因以及潜行于细胞内该病毒的血凝集素基因,似乎在毒力方面起着关键性的作用.研究结果发表于2005年10月7日的Science上.研究者断定,1918流感病毒基因如何使该病毒产生如此致命性.根据这个信息,科学家就可以研制出新的疫苗或药物,抗击未来的流感暴发. (李潇摘译自C.Brownlee:Science News,October 8,2005,Vol.168,p.227)     

科研快讯

《科学》:"万能"流感疫苗研究获进展由斯克里普斯研究所和荷兰Crucell疫苗研究所的科学家们领导的一个研究小组发现了三种可保护小鼠抵御2种主要的乙型流感病毒株的人类抗体。相关成果发表在《科学》(Science)杂志上。乙型流感病毒被认为相较于甲型流感病毒不那么危险,由于它们突变形成致命流行病毒株的     

Spatial,Temporal and Genetic Dynamics Characteristics of Influenza B Viruses in China, 1973–2018

Annual influenza B virus epidemics and outbreaks cause severe influenza diseases in humans and pose a threat to public health. China is an important epidemic area of influenza B viruses. However, the spatial, temporal transmission pathways and the demography history of influenza B viruses in China remain unknown. We collected the haemagglutinin gene sequences sampled of influenza B virus in China between 1973 and 2018. A Bayesian Markov chain Monte Carlo phylogeographic discrete approach was used to infer the spatial and temporal phylodynamics of influenza B virus. The Bayesian phylogeographic analysis of influenza B viruses showed that the North subtropical and South subtropical zones are the origins of the Victoria and Yamagata lineage viruses, respectively. Furthermore, the South temperate and North subtropical zones acted as transition nodes in the Victoria lineage virus dispersion network and that the North subtropical and Mid subtropical zones acted as transition nodes in the Yamagata lineage virus dispersion network. Our findings contribute to the knowledge regarding the spatial and temporal patterns of influenza B virus outbreaks in China.     

Influenza B viruses with site-specific mutations introduced into the HA gene.

We have succeeded in engineering changes into the genome of influenza B virus. First, model RNAs containing the chloramphenicol acetyltransferase gene flanked by the noncoding sequences of the HA or NS genes of influenza B virus were transfected into cells which were previously infected with an influenza B helper virus. Like those of the influenza A viruses, the termini of influenza B virus genes contain cis-acting signals which are sufficient to direct replication, expression, and packaging of the RNA. Next, a full-length copy of the HA gene from influenza B/Maryland/59 virus was cloned. Following transfection of this RNA, we rescued transfectant influenza B viruses which contain a point mutation introduced into the original cDNA. A series of mutants which bear deletions or changes in the 5' noncoding region of the influenza B/Maryland/59 virus HA gene were constructed. We were able to rescue viruses which contained deletions of 10 or 33 nucleotides at the 5' noncoding region of the HA gene. The viability of these viruses implies that this region of the genome is flexible in sequence and length.     

GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒

本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT-PCR检测方法,该方法可以同时检测12种呼吸道病毒,包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒。针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物,分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性。多重检测体系在10~3拷贝/μL水平可同时检测到12种病毒。另检测24份临床标本,以real-time RT-PCR为参考标准,进一步验证检测体系。结果表明,这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强,可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒。     

基于Web服务的流感病毒基因组自动化翻译注释系统

随着流感病毒基因组测序数据的急剧增加,深入挖掘流感病毒基因组大数据蕴含的生物学信息成为研究热点。基于中国流感病毒流行特征数据,建设一个集自动化、一体化和信息化的序列库系统,对于实现流感病毒基因组批量快速翻译、注释、存储、查询、分析具有重要的应用价值。本课题组通过集成一系列软件和工具包,并结合自主研发的其他功能,在底层维护的2个关键的参考数据集基础上另外追加了翻译注释信息最佳匹配的精细化筛选规则,构建具有流感病毒基因组信息存储、自动化翻译、蛋白序列精准注释、同源序列比对和进化树分析等功能的自动化系统。结果显示,通过Web端输入fasta格式的流感病毒基因序列,本系统可针对参考序列片段数据集(blastdb.fasta)进行Blast同源性检索,可以鉴定流感病毒的型别(A、B或C)、亚型和基因片段(1~8片段);在此基础上,通过查询数据库底层用于翻译、注释的基因片段参考数据集,可以获得一组肽段数据集,然后通过循环调用ProSplign软件对其进行预测。结合精细化的筛选准入规则,选出与输入序列匹配最好的翻译后产物,作为该输入序列的预测蛋白,输出为gbk,asn和fasta等通用格式的文件,给出序列长度、是否全长、病毒型别、亚型、片段等信息。基于以上工作,另外自主研发了系统其他的附加功能如进化树分析展示、基因组数据存储等功能,构建成基于Web服务的流感病毒基因组自动化翻译注释系统。本研究提示,系统高度集成系列软件以及自有的注释翻译数据库文件,实现从序列存储、翻译、注释到序列分析和展示的功能,可全面满足我国高通量基因检测数据共享化、本土化、一体化、自动化的需求。     

Evolutionary pattern of the hemagglutinin gene of influenza B viruses isolated in Japan: cocirculating lineages in the same epidemic season.

The unexpectedly low efficacy of influenza vaccine during school outbreaks of influenza B virus in the spring of 1987 in Japan was probably attributable to a poor antibody response of vaccinees to the epidemic viruses. An antigenic analysis of the causative B viruses isolated in 1987 and 1988 showed much variation in hemagglutination inhibition patterns. The nucleotide sequences that code for the HA1 domain of B/Fukuoka/c-27/81, B/Ibaraki/2/85, B/Nagasaki/1/87, and B/Yamagata/16/88 viruses were determined and compared with those of the previously reported hemagglutinin genes. The nucleotide sequences of the hemagglutinin gene of a new variant, B/Yamagata/16/88, had only 93.4% homology with those of two other viruses from the same epidemic. An analysis of nucleotide and amino acid substitutions of the hemagglutinin genes of influenza B viruses revealed that new and some old variants could cocirculate in the same epidemic. A phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining method allowed estimation of an evolutionary rate of 2.3 x 10(-3) synonymous (silent) substitutions per nucleotide site per year in the hemagglutinin gene.     

Host-Specific and Segment-Specific Evolutionary Dynamics of Avian and Human Influenza A Viruses: A Systematic Review

Understanding the evolutionary dynamics of influenza viruses is essential to control both avian and human influenza. Here, we analyze host-specific and segment-specific Tajima’s D trends of influenza A virus through a systematic review using viral sequences registered in the National Center for Biotechnology Information. To avoid bias from viral population subdivision, viral sequences were stratified according to their sampling locations and sampling years. As a result, we obtained a total of 580 datasets each of which consists of nucleotide sequences of influenza A viruses isolated from a single population of hosts at a single sampling site within a single year. By analyzing nucleotide sequences in the datasets, we found that Tajima’s D values of viral sequences were different depending on hosts and gene segments. Tajima’s D values of viruses isolated from chicken and human samples showed negative, suggesting purifying selection or a rapid population growth of the viruses. The negative Tajima’s D values in rapidly growing viral population were also observed in computer simulations. Tajima’s D values of PB2, PB1, PA, NP, and M genes of the viruses circulating in wild mallards were close to zero, suggesting that these genes have undergone neutral selection in constant-sized population. On the other hand, Tajima’s D values of HA and NA genes of these viruses were positive, indicating HA and NA have undergone balancing selection in wild mallards. Taken together, these results indicated the existence of unknown factors that maintain viral subtypes in wild mallards.     

The Evolutionary Dynamics of Human Influenza B Virus

Despite their close phylogenetic relationship, type A and B influenza viruses exhibit major epidemiological differences in humans, with the latter both less common and less often associated with severe disease. However, it is unclear what processes determine the evolutionary dynamics of influenza B virus, and how influenza viruses A and B interact at the evolutionary scale. To address these questions we inferred the phylogenetic history of human influenza B virus using complete genome sequences for which the date (day) of isolation was available. By comparing the phylogenetic patterns of all eight viral segments we determined the occurrence of segment reassortment over a 30-year sampling period. An analysis of rates of nucleotide substitution and selection pressures revealed sporadic occurrences of adaptive evolution, most notably in the viral hemagglutinin and compatible with the action of antigenic drift, yet lower rates of overall and nonsynonymous nucleotide substitution compared to influenza A virus. Overall, these results led us to propose a model in which evolutionary changes within and between the antigenically distinct 'Yam88' and 'Vic87' lineages of influenza B virus are the result of changes in herd immunity, with reassortment continuously generating novel genetic variation. Additionally, we suggest that the interaction with influenza A virus may be central in shaping the evolutionary dynamics of influenza B virus, facilitating the shift of dominance between the Vic87 and the Yam88 lineages.     

Genetic recombination for antigenic markers of antigenically different strains of influenza B virus

Incorporation of trypsin in agar overlay or fluid maintenance media resulted in enhancement of plaquing efficiency and replication of influenza B viruses in primary chicken embryo fibroblasts. Using this improved technique, recombination was attempted with two serologically distinct strains of influenza B virus, B/Lee/40 and B/Massachusetts/1/71. After mixed infection, two virus clones were selected and characterized in detail. Hemagglutination inhibition and neuraminidase inhibition tests showed that these viruses are reciprocal antigenic recombinants with hemagglutinin derived from one parent and neuraminidase from the other. Serological examinations of the antisera to these recombinants confirmed the results. The frequency of recombination was high in the present system and 64% of the virus clones isolated without selection from the mixed yield were recombinants. This high recombination frequency is consistent with the genomic reassortment that is characteristic of recombination of influenza A viruses.     

禽流感病毒分型基因芯片的研制

[目的]禽流感病毒是一种全球重要的人和动物呼吸道病病原,快速确定其不同亚型对于全球流感监测具有重要的意义.本研究意在研制一种可同时鉴定禽流感病毒所有亚型的方法.[方法]根据GenBank上已发表的禽流感病毒不同亚型(16个HA亚型和9个NA亚型)的基因序列,设计合成了25对特异性引物和1对通用引物,然后以各亚型病毒的参考株RNA作为模板,建立扩增不同亚型的多重RT-PCR方法.参考各亚型病毒靶cDNAs区域的保守序列设计了52条亚型特异的探针,进而利用扩增的各亚型病毒的靶cDNAs对其特异性进行评价.在此基础上,将设计好的探针点制到处理好的玻片上,制备了禽流感病毒分型鉴定基因芯片,结合所建立的扩增不同亚型的多重RT-PCR方法,开发了禽流感病毒亚型鉴定基因芯片试剂.利用收集自49个地区的2653份标本对其特异性和敏感性进行了初步评价.[结果]用于评价的各亚型参考毒株均出现良好的特异性杂交信号,检测的敏感度可达2.47 PFU/mL或2.5 ng靶DNA片段,而且与禽类常见的IBV、NDV等6种病毒均无交叉反应.[结论]证明该病毒分型基因芯片具有良好的特异性、敏感性.