基于PTS缺陷型大肠杆菌构建莽草酸生产菌

对大肠杆菌芳香族氨基酸合成途径进行代谢流改造, 以实现高效的生物制备莽草酸。以磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS系统)敲除菌DH5α△ptsHIcrr (DHP)为基础, 特异性敲除aroL、ydiB基因并转入受阿拉伯糖诱导表达的T7-RNA聚合酶基因, 最终构建一系列产莽草酸宿主菌。再将aroE、aroB、tktA、glk、aroFfbr组成的系列基因串联起来置于质粒上, 在T7启动子控制下表达, 经摇瓶培养检测得知, 不同重组菌产莽草酸能力与对照相比均有明显提高, 其中DHPYA-T7/pAOC-TGEFB菌株产量最高, 可达到392 mg/L。为进一步构建高表达莽草酸工程菌奠定基础。     

理性设计和构建过量合成莽草酸的大肠杆菌代谢工程菌

利用代谢工程手段理性改造野生大肠杆菌的莽草酸(Shikimic acid,SA)合成途径及相关代谢节点,以构建高产莽草酸的工程菌株.根据细胞代谢网络分析,利用Red-Xer重组系统连续删除了野生型大肠杆菌CICIMB0013的莽草酸激酶基因(aroL、aroK),葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的关键组分EIICBglc的编码基因(ptsG)以及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因(ydiB)并系统评价了基因删除对细胞的生长、葡萄糖代谢和莽草酸积累的影响.aroL、aroK的删除阻断了莽草酸进一步转化成为莽草酸-3-磷酸,初步提高莽草酸的累积.删除ptsG基因使大肠杆菌PTS系统部分缺失,细胞通过GalP-glk(半乳糖透性酶-葡萄糖激酶)途径,利用ATP将葡萄糖磷酸化后进入细胞.利用该途径运输葡萄糖能够减少PEP的消耗,使得更多的碳代谢流进入莽草酸合成途径,从而显著提高了莽草酸的产量.在此基础上删除ydiB基因,阻止了莽草酸合成的前体物质3-脱氢奎宁酸转化为副产物奎宁酸(Quinic acid,QA),进一步提高了莽草酸的累积.初步发酵显示4个基因缺失的大肠杆菌代谢工程菌生产莽草酸的能力比原始菌提高了90多倍.     

利用代谢工程改善大肠杆菌的3-脱氢莽草酸生产

3-脱氢莽草酸是芳香族氨基酸合成代谢途径中的一种重要中间产物。除可作为一种高效的抗氧化剂,还可用于合成己二酸、香草醛等一些重要的化工产品,具有重要的应用价值。相关研究证明具有去酪氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroFFBR以及转酮醇酶基因tktA可以有效影响3-脱氢莽草酸的过量合成。通过增加aroFFBR和tktA串联过量表达的拷贝数,可使工程菌株在摇瓶发酵条件下3-脱氢莽草酸产量提高2.93倍。通过同源重组无痕基因敲除技术依次敲除出发菌大肠杆菌Escherichia coli AB2834的乳酸、乙酸、乙醇等副产物合成途径中的重要基因ldhA、ackA-pta和adhE,可使工程菌株的3-脱氢莽草酸产量进一步提高,达到了1.83 g/L,是初始出发菌株大肠杆菌E.coli AB2834产量的6.7倍。利用5 L发酵罐进行分批补料发酵,62 h后工程菌株3-脱氢莽草酸产量达到了25.48 g/L。本研究可为构建有应用前景的3-脱氢莽草酸生产菌株提供重要参考。     

单棕榈酰莽草酸的高效液相色谱-蒸发光散射检测法定量测定

本文建立一种采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法定量测定单棕榈酰莽草酸的方法。色谱条件:色谱柱:反相Symmetry C18柱4.6×250 mm i.d.(填料粒度5μm),柱温30℃,流动相:乙腈-水-甲酸(80∶20∶0.2);流速0.8 mL/min;ELSD漂移管温度:80℃,载气流速:2 L/min。3-,4-和5-棕榈酰莽草酸纯品采用酶法合成,合成产物经柱层析和高效液相色谱制备纯化得到纯品。在该色谱条件下,3-,4-和5-棕榈酰莽草酸在0.21~4.12μg的范围内,其质量与其峰面积线性关系良好(r=0.9991,0.9998,0.9997),回收率分别为95.2~98.7%,96.1%~98.2%,96.3%~98.5%;RSD分别为1.6%,1.8%,1.9%。实验结果表明该方法具有简便、快速、准确、重现性较好的特点,可以用于定量分析单棕榈酰莽草酸,尤其适用于非水相酶促反应合成体系中的产物检测。     

莽草酸的生物合成研究进展

莽草酸(shikimic acid, SA)是一种重要的天然化合物,在生物体内具有抗病毒、抗血栓、镇痛、抑菌、抑制恶性肿瘤等多重功能,广泛应用于医药、化妆品、食品和农业等领域,因此被视为是极具潜力的生物分子。作为芳香族化合物的前体,莽草酸在生物体内的代谢途径中起着重要作用。传统的莽草酸生产方式主要依赖于从植物(如八角茴香)中提取或通过化学合成,这些方法不仅成本高、效率低,还对环境造成负担。随着合成生物学和代谢工程技术的不断进步,利用生物代谢工程技术生产莽草酸因其更高的可持续性和经济性,逐渐成为研究热点。本文综述了莽草酸的应用领域及其生产方法,并重点阐述了其生物合成的研究进展与优化策略。     

途径工程改造谷氨酸棒杆菌产莽草酸

莽草酸是一种芳香族中间代谢产物,也是合成抗禽流感药物磷酸奥司他韦的前体。目前,国内外莽草酸的生产主要依靠成本较高,周期较长的植物提取法。微生物发酵法合成莽草酸具有生产成本低、周期短等优势成为研究的热点。为了构建产莽草酸的重组谷氨酸棒杆菌,此次研究从基因组水平上对谷氨酸棒杆菌体内的莽草酸代谢途径进行代谢工程改造。通过阻断莽草酸分解代谢途径、解除反馈抑制以及阻断竞争性代谢途径的策略,实现了莽草酸产量的大幅提升。结果显示,所构建的重组谷氨酸棒杆菌SKA06经72 h摇瓶发酵,莽草酸产量达到7.61 g/L,相较出发菌种提升了68倍。并且,基于染色体工程的遗传改造策略克服了引入质粒带来传代不稳定、需要添加抗生素等问题,可以为莽草酸工程菌种的选育提供重要参考。     

响应曲面法优化马尾松中莽草酸的超声提取工艺

以马尾松松针为原料,采用超声波提取法从松针粉中提取莽草酸,通过考察料液比((VH2O∶m松针粉,mL:g)、提取时间、提取温度及超声波功率等因素对松针中总莽草酸含量的影响,并在单因素试验的基础上,选取料液比、提取时间、超声波功率3个变量,进行Box-Behnken中心组合设计优化,获得马尾松松针中莽草酸的最佳提取工艺参数为料液比1∶26,提取时间为46min,超声波功率为359 W,此条件下莽草酸的提取率为1.948%。     

八角茴香春果和秋果以及不同部位的莽草酸含量分析

采用HPLC法对不同季节和不同部位的八角茴香药材主成分莽草酸的含量进行分析,发现枝条、叶片、春果、秋果的莽草酸含量依次为2.64%、4.94%、8.63%、12.16%;色谱条件:Venusil HILIC(5μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱,流动相:乙腈-0.5%三氟乙酸(95:5),流速1.0 mL·min~(-1),检测波长为210 nm。莽草酸进样量在0.001～6μg范围内线性关系良好。莽草酸的线性回归相关系数r=0.9984,平均回收率为98.4%,相对标准偏差(RSD)为1.26%。该研究为制定八角茴香药材质量检测标准提供了简便、快速、准确的方法。     

温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨

【目的】L-丙氨酸的存在导致Escherichia coli的生长速率显著降低,最终会降低发酵过程中L-丙氨酸的体积合成速率。用温度调节基因开关(λpR-pL)高效、动态调控重组E. coli菌株菌体生长与L-丙氨酸合成过程,使两者相协调。【方法】以野生型E. coli B0016为出发菌株,敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径以及丙氨酸消旋酶编码基因(ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA、dadX),获得菌株B0016-060B。将嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的L-丙氨酸脱氢酶基因(alaD)克隆于pL启动子下游,并在B0016-060B菌株中表达,获得菌株B0016-060B/pPL-alaD,进行摇瓶和发酵罐发酵考察菌体生长和L-丙氨酸发酵性能。【结果】竞争代谢途径的敲除显著降低了副产物合成量,仅形成极少量的乙酸、琥珀酸和乙醇。28 °C下菌株B0016-060B/pPL-alaD几乎不合成L-丙氨酸,可保证菌体快速生长;而在42 °C下可高效合成L-丙氨酸。经发酵罐发酵,可合成67.2 g/L L-丙氨酸,体积生产强度达到2.06 g/(L·h)。【结论】通过发酵培养温度的简单切换,分阶段实现了细胞的快速增量和L-丙氨酸的高强度合成。     

腺嘌呤对大肠杆菌DH5α和其耐乙酸突变株DA19 代谢流分布的影响

【目的】本文通过分析在基本培养基中添加腺嘌呤对大肠杆菌DH5α和其耐乙酸突变株DA19代谢流分布的影响,从而进一步了解二者在代谢调控方面的差异。【方法】对2个菌株分别在氮源限制基本培养基及添加腺嘌呤的氮源限制基本培养基中进行连续培养,分析两者代谢流变化差异,并与酶活测定结果进行比较。【结果】添加腺嘌呤降低了DH5α的葡萄糖比消耗速率和乙酸的比生成速率,提高了菌体关于葡萄糖的得率,而丙酮酸比生成速率变化不明显。与MN培养基相比,添加腺嘌呤后DH5α降低了乙酸分流比,提高了分泌丙酮酸和三羧酸循环分流比,同时明显改变了磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和乙酸激酶酶活。与DH5α不同,添加腺嘌呤使得DA19的丙酮酸比生成速率增加了近57%,而其它参数无明显改变。与MN培养基相比,DA19在添加腺嘌呤后降低了三羧酸循环分流比,大大提高了分泌丙酮酸分流比,而关键酶活未发生明显改变。酶活变化与代谢流结果基本一致。【结论】由于大肠杆菌DH5α和DA19嘌呤核苷酸从头合成途径能力存在差异,因此添加腺嘌呤对两个菌株的代谢流分布产生了完全不同的影响。     

Synthesis,biological activity and molecular modelling studies of shikimic acid derivatives as inhibitors of the shikimate dehydrogenase enzyme of Escherichia coli

Shikimic acid (SA) pathway is the common route used by bacteria, plants, fungi, algae, and certain Apicomplexa parasites for the biosynthesis of aromatic amino acids and other secondary metabolites. As this essential pathway is absent in mammals designing inhibitors against implied enzymes may lead to the development of antimicrobial and herbicidal agents harmless to humans. Shikimate dehydrogenase (SDH) is the fourth enzyme of the SA pathway. In this contribution, a series of SA amide derivatives were synthesised and evaluated for in vitro SDH inhibition and antibacterial activity against Escherichia coli. All tested compounds showed to be mixed type inhibitors; diamide derivatives displayed more inhibitory activity than synthesised monoamides. Among the evaluated compounds, molecules called 4a and 4b were the most active derivatives with IC₅₀ 588 and 589?µM, respectively. Molecular modelling studies suggested two different binding modes of monoamide and diamide derivatives to the SDH enzyme of E. coli.     

基于代谢流量分布信息理解大肠杆菌中异柠檬酸裂解酶调节因子的代谢调控作用

基因的表达受不同的转录调节因子调节。大肠杆菌中的异柠檬酸裂解酶调节因子(IclR)能够抑制编码乙醛酸支路酶的aceBAK操纵子的表达。本研究基于代谢物的13C同位体物质分布来定量解析代谢反应,主要研究了iclR基因在大肠杆菌生理和代谢中的作用。大肠杆菌iclR基因缺失突变株的生长速率、糖耗速率和乙酸的产量相对于原始菌株都有所降低,但菌体得率略有增加。通过代谢途径的流量比率分析发现基因缺失株的乙醛酸支路得到了激活,33%的异柠檬酸流经了乙醛酸支路;戊糖磷酸途径的流量变小,使得CO2的生成量减少。同时,乙醛酸支路激活,但草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的流量基本不变,说明磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循环没有激活,没有过多的碳原子在磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶反应中以CO2形式排出,从而确保了菌体得率。葡萄糖利用速率的降低、乙酰辅酶A的代谢效率提高等使得iclR基因敲除菌的乙酸分泌较原始菌株有所降低。     

好氧发酵生产琥珀酸工程菌株的构建

通过分析大肠杆菌的碳源代谢途径, 利用基因敲除手段, 以Escherichia coli MG1655为出发菌株, 成功构建了琥珀酸好氧发酵生产工程菌E. coli QZ1111 (MG1655?ptsG?poxB?pta?iclR?sdhA)。检测结果表明该菌株能以葡萄糖为碳源, 在好氧发酵且不表达任何异源基因的条件下大量积累琥珀酸。摇瓶试验证明, 琥珀酸发酵产量达到26.4 g/L, 乙酸盐作为唯一检测到的副产物产量为2.3 g/L。二者浓度比达到11.5:1。