壳聚糖纳米粒介导基因转染的影响因素及改性修饰

壳聚糖带正电荷,可与带负电荷的DNA结合形成纳米级的多聚复合物(纳米粒)。作为一种基因载体,壳聚糖对DNA具有很好的结合和保护作用,对生物体无毒、相容性好,被广泛应用于基因转染及基因预防和治疗中。壳聚糖的主要缺点是转染效率较低,但对其进行改性或修饰后,有可能提高其转染效率。     

分枝PEI 修饰的PLGA 纳米粒转染DNA 的研究*

目的:建立基于聚(乳酸-羟基乙酸)纳米粒(PLGA)载DNA的基因转染体系,比较用空白聚(乳酸-羟基乙酸)纳米粒(PLG-A-E)吸附质粒DNA和用分枝PEI修饰后的PLGA纳米粒(PLGA-BPEI)吸附质粒DNA优缺点。方法:用乳化蒸发法制备纳米粒,对纳米粒进行表征研究,包括包封率、Zeta电位、粒径大小、稳定性,用荧光显微镜观察它们对NIH3T3和HEK293细胞的转染效率,用MTT检测对它们细胞的毒性。结果:制备了两种基于PLGA的纳米粒,PLGA-E和PLGA-BPEI粒径大小为200-270nm,zeta电位为0-30mV,在血清和不同的pH值时两者均较稳定,转染效率PLGA-BPEI较PLGA-E高,且释放时间早,但前者较后者对细胞毒性大。结论:这两种基于PLGA纳米粒均能有效转染质粒DNA,它们存在不同的优缺点,应根据不同需要进行选择。     

载基因壳聚糖纳米粒的制备及免疫增强作用的初步研究

摘 要 目的: 制备壳聚糖载基因纳米粒，并对其体外转染效率及其在小鼠体内的免疫增强效果进行初步研究。方法: 以本课题组构建的口蹄疫DNA疫苗为模型药物，采用复凝聚法制备纳米粒；用透射电镜观察形态；用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位；凝胶阻滞分析测定基因在纳米粒中的位置；用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性。用载基因壳聚糖纳米粒免疫雌性Balb/c小鼠，检测免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果: 所制备的载基因纳米粒形态规则、大多成球形，平均粒径约为150nm,多分散度＜0.26,zeta电位约为21mV；凝胶分析结果表明质粒DNA与壳聚糖分子间可以通过电性结合作用而完全结合，基因几乎全部被包裹在纳米粒内部；体外基因转染实验表明壳聚糖作为一种新型的非病毒基因递送载体能够高效传递DNA进入BHK-21细胞，基因能够在该细胞中高效表达；小鼠免疫实验表明纳米粒不仅能诱导机体产生较高的细胞免疫水平，而且体液免疫水平也显著提高。结论: 壳聚糖纳米粒能将基因递送到细胞内并且能够表达，小鼠免疫实验显示其具有良好的免疫增强效果。     

CHO-K1细胞中基因瞬时转染的条件优化

目的:以CHO-K1细胞为宿主基因瞬时转染条件的优化.方法:以GFP(Green Fluorescence Protein)为报告基因,考察了DNA∶PEI比例、DNA用量及血清的加入对CHO-K1细胞的转染效率和细胞数目的影响.结果:DNA∶PEI=1∶2(w/w)、2 gDNA/106 cells时,转染结果最优;血清的加入可降低细胞转染效率.结论:在CHO-K1细胞中进行瞬时转染的最佳条件为DNA∶PEI=1∶2(w/w)、2 gDNA/106 cells,及血清的加入抑制细胞转染.     

新型纳米转染试剂转染PNP自杀基因体外杀伤实验

将壳聚糖纳米粒包裹的报告基因pEGFP-N1质粒转染至HEK293细胞,并在HEK293细胞中成功表达荧光蛋白的基础上,进一步将本室自行构建的PNP基因的真核高效表达载体质粒pcDNA3-PNP转染至HEK293细胞。转染72h后,对转染的HEK293细胞给予前体药6-MPDR至终浓度40μg/ml,一天后,采用MTT比色法测定药物对细胞增值的影响,并进行统计学处理。实验结果表明采用壳聚糖纳米粒转染试剂转染并给予前体药6-MPDR的实验组活细胞数,与用壳聚糖转染但不给前体药6-MPDR的对照组活细胞数相比,有显著差异(P<0.05),说明新筛选出的壳聚糖纳米粒转染试剂可以将PNP自杀基因递送至靶细胞中,并在细胞中进行表达,从而使PNP/6-MPDR自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用。分别采用相同工作浓度的脂质体与壳聚糖纳米粒转染试剂转染相同浓度的基因质粒,壳聚糖纳米粒对靶细胞生长数量影响很小,说明的壳聚糖纳米粒细胞毒性大大低于阳离子脂质体的细胞毒性。     

新型阳离子基因传递载体PEI-PBLG的细胞转染研究

对新型阳离子聚合物PEI(10kD)-PBLG进行研究,重点考察其基因转染效率与细胞毒性,探讨其作为基因载体的可能性。通过粒径分析及扫描电镜(SEM)观察PEI(10kD)-PBLG与质粒pEGFP自组装形成的颗粒形态及粒径,预测其进入细胞的可能性。使用MTT比色法分析PEI(10kD)-PBLG、PEI(25kD)-PBLG、PEI(10kD)和PEI(25kD)的细胞毒性差异。选用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP作为报告基因模型,将其与PEI(10kD)-PBLG自组装后,分别转染真核细胞株Hela、COS-7、Vero-E6和ECV304,应用流式细胞术检测细胞转染效率,并比较了血清、缓冲液、细胞谱等多种因素对基因转染效率的影响。PEI(10kD)-PBLG可包裹质粒形成粒径100~120nm的纳米复合物,适合介导质粒进入细胞。该纳米粒复合物对转染缓冲液的敏感度较低,并能够在10%血清存在的条件下,转染全部实验用细胞株,尤其对Hela的转染效率最高,其次是COS-7、Vero-E6和ECV304;其中PEI-PBLG(10kD)/pEGFP复合物转染Hela细胞的比率为45.02%,高于PEI(10kD)/pEGFP的29.16%;PEI(10kD)-PBLG的细胞毒性作用显著低于PEI(25kD)、PEI(10kD)和PEI(25kD)-PBLG。新型阳离子多聚物PEI(10kD)-PBLG在提高PEI介导的基因转染效率的同时降低了其细胞毒性,提高了生物相容性,有望成为基因转移的有效载体。     

低分子量聚乙亚胺介导的基因转染系统及动物皮肤组织基因转染试验

将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺(PEI)结合,用肝癌细胞株CM7221实验,研究其转染效率及可能引起的细胞毒性;进一步用此PEI/DNA复合物转染小鼠皮肤组织,通过报告基因检测,研究转染基因的表达位置及持续表达时间。结果发现,低分子量PEI介导的细胞转染效率最高可达55%,转染效率与PEI结构无关,但是随着分子量的增加,转染活性略有下降。同时,随着分子量的增加,PEI对细胞的毒性也相应的加大;动物皮肤转染实验显示,转染24h后,GFP基因在皮肤组织的毛囊、汗腺、皮脂腺等处高效表达,表达可持续7天。表明低分子量PEI是低毒性、高转染效率的有用非病毒转染载体,能够在动物皮肤组织中进行基因转移,这对皮肤疾病的基因治疗具有潜在的应用价值。     

壳聚糖作为基因药物载体的研究进展

以壳聚糖及其衍生物作为基因的载体的转染效率受到许多因素的影响, 如复合物粒子大小、壳聚糖/DNA的比值、壳聚糖的分子量、脱乙酰度、转染过程中血清的浓度、介质的pH值等。对壳聚糖进行一定程度的修饰, 可以改变壳聚糖的转染效率。介绍了壳聚糖作为基因转移载体的转染条件, 转染效率和转染机制的研究情况及研究进展。     

叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA纳米粒的构建及其对胃癌细胞增殖的影响

目的:探讨叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA纳米粒对胃癌细胞生长的影响。方法:制备靶向性叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA纳米粒,原子力显微镜观察其形态,激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径;倒置荧光显微镜观察叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA纳米粒的转染效率;采用蛋白质印迹法检测胃癌细胞Prdx6蛋白的表达变化;CCK8细胞增殖实验检测胃癌细胞的存活率。结果:1制备成功叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA向纳米粒。2荧光显微镜下观察靶向性叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA纳米粒转染胃癌细胞的效率明显高于非靶向纳米粒;胃癌细胞转染靶向组纳米粒后Prdx6蛋白的表达显著低于非靶向组。3与对照组相比,叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA纳米粒能够明显抑制胃癌细胞的增殖(P0.01)。结论:1叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA纳米粒可高效转染胃癌细胞。2转染叶酸-壳聚糖Prdx6 shRNA纳米粒后胃癌细胞的生长明显受抑制。     

低分子量聚乙亚胺介导的基因转染系统及动物皮肤组织基因转染试验

将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺(PEI)结合,用肝癌细胞株CM7221实验,研究其转染效率及可能引起的细胞毒性;进一步用此PEI／DNA复合物转染小鼠皮肤组织,通过报告基因检测,研究转染基因的表达位置及持续表达时间。结果发现,低分子量PEI介导的细胞转染效率最高可达550%,转染效率与PEI结构无关,但是随着分子量的增加,转染活性略有下降。同时,随着分子量的增加,PEI对细胞的毒性也相应的加大;动物皮肤转染实验显示,转染24h后,GFP基因在皮肤组织的毛囊、汗腺、皮脂腺等处高效表达,表达可持续7天。表明低分子量PEI是低毒性、高转染效率的有用非病毒转染载体,能够在动物皮肤组织中进行基因转移,这对皮肤疾病的基因治疗具有潜在的应用价值。     

类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程

类胡萝卜素具有多种生物功能,尤其在保护人类健康方面起着重要的作用,如它们是合成维生素A的前体,能够增强人体免疫力和具有防癌抗癌的功效。人体自身不能合成类胡萝卜素,必须通过外界摄入;但类胡萝卜素在许多植物中含量较低,并且很难用化学方法合成。随着类胡萝卜素生物合成途径的阐明及其相关基因的克隆,运用基因工程手段调控类胡萝卜素的生物合成已成为可能。本文综述了微生物和高等植物类胡萝卜素生物合成途径中相关基因的克隆,以及运用这些基因通过异源微生物生产类胡萝卜素和提高作物类胡萝卜素含量的基因工程研究进展。     

基因打靶突变小鼠与基因功能研究

ES细胞是建立基因打靶突变小鼠的必要条件 ,也可用于制备转基因动物 .基因敲除、精细突变和条件性基因打靶技术建立的基因打靶突变小鼠在人类遗传病机理研究、基因治疗和基因功能研究方面都有着重要作用 .     

基因诱捕技术及基因诱捕数据库

基因诱捕（gene trap）是基于小鼠胚胎干细胞、报道载体（诱捕载体）建立的一种基因突变方法。诱捕载体在整合位点利用内源基因调控元件模仿内源基因表达,使其表达终止,从而可以阐明内源基因的功能。由于诱捕载体及其报道基因的特点,基因诱捕技术可用于高通量生产,便于小鼠基因功能的大规模研究．为各类疾病动物模型的建立奠定良好基础。     

益生菌的功能基因导入和基因编辑

益生菌已经在临床和食品领域应用多年,其安全性和有效性已经获得人们的认可。随着分子生物学技术的发展,采用益生菌作为载体进行基因导入或基因编辑,这些遗传改造的益生菌一部分已经作为新的药品或疫苗进入到临床应用阶段。携带功能基因的益生菌定殖于肠道进行表达和缓慢释放,这类益生菌作为活体药物获得益生菌和功能基因的双重功效,可用于治疗某些疑难病症。携带蛋白质抗原基因的益生菌定殖于肠道进行表达,可诱导肠道黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫,这是一条更安全的口服疫苗途径。成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)以其高效与便捷性推动了益生菌基因编辑的发展。这篇综述介绍了CRISPR-Cas9操作系统在益生菌方面的应用。对传统遗传操作较难的益生菌采用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑,使其基因敲除和基因突变,基因敲入和基因调控等更为简单、高效和易操作。这些CRISPR/Cas9、CRISPRa和CRISPRi技术在益生菌的基因表达调控和代谢工程等领域具有巨大的应用潜力,例如医药、食品以及工业等相关重要产品的获得。本文总结了益生菌基因导入和基因编辑在生物制品生产中的相关应用,最后对其未来的研究方向进行展望。     

Gene Conversions May Obscure Actin Gene Family Relationships

Phylogenetic hypotheses of muscle actin evolution are significantly different when a sea urchin is used as a representative echinoderm than when a sea star is used. While sea urchin muscle actins support an echinoderm–chordate sister relationship, sea star sequences suggest that echinoderm muscle actins are convergent with chordate muscle actins. Our results suggest that gene conversion in the sea star muscle actin may be responsible for these discordant results. Received: 19 July 1999 / Accepted: 1 October 1999     

壳聚糖作为基因治疗载体的研究

本文从壳聚糖－DNA复合物／微球的形成方法和机理,稳定性,转染细胞效率等方面综述了壳聚糖在基因治疗领域目前的研究现状。     

Identifying Gene Interaction Enrichment for Gene Expression Data

Gene set analysis allows the inclusion of knowledge from established gene sets, such as gene pathways, and potentially improves the power of detecting differentially expressed genes. However, conventional methods of gene set analysis focus on gene marginal effects in a gene set, and ignore gene interactions which may contribute to complex human diseases. In this study, we propose a method of gene interaction enrichment analysis, which incorporates knowledge of predefined gene sets (e.g. gene pathways) to identify enriched gene interaction effects on a phenotype of interest. In our proposed method, we also discuss the reduction of irrelevant genes and the extraction of a core set of gene interactions for an identified gene set, which contribute to the statistical variation of a phenotype of interest. The utility of our method is demonstrated through analyses on two publicly available microarray datasets. The results show that our method can identify gene sets that show strong gene interaction enrichments. The enriched gene interactions identified by our method may provide clues to new gene regulation mechanisms related to the studied phenotypes. In summary, our method offers a powerful tool for researchers to exhaustively examine the large numbers of gene interactions associated with complex human diseases, and can be a useful complement to classical gene set analyses which only considers single genes in a gene set.     

基因陷阱

本文综述了功能基因组学研究中的新热点——基因陷阱的原理与方法,应用和优缺点。