嗜热枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的表达与重组酶的性质

克隆嗜热枯草芽孢杆菌WY-34普鲁兰酶基因并在大肠杆菌中进行表达,对重组酶进行纯化和酶学性质研究,根据枯草芽孢杆菌的普鲁兰酶蛋白序列,设计PCR引物对WY-34的普鲁兰酶基因进行克隆及异源表达.对表达蛋白的最适pH、pH稳定性及最适温度、温度稳定性等特性进行研究,并测定重组普鲁兰酶的底物特异性.将普鲁兰酶基因pluA克隆及分析序列后,发现基因长度为2.2 kb,编码718个氨基酸,在大肠杆菌中异源表达.通过Ni-IDA亲和层析一步纯化得到比活力为93.2 U/mg的纯酶,SDS-PAGE和凝胶层析测定的分子量分别为76.2 kD和74.3 kD.酶学性质研究表明,该酶的最适温度为40℃,在温度不高于45℃条件下稳定;最适pH为6.0,同一温度下pH 6.0-9.0范围内处理30 min可以保持80％以上的酶活力,此酶对普鲁兰糖有很强的底物特异性.此重组普鲁兰酶的酶学性质表明此酶具有一定的工业化应用价值.     

蜡样芽胞杆菌GXBC-3三个普鲁兰酶基因的表达及其酶学特性

探索获得优良的新型普鲁兰酶基因,丰富普鲁兰酶理论,对实现普鲁兰酶国产化具有重要意义。分析GenBank数据库中蜡样芽胞杆菌假定Ⅰ型、Ⅱ型普鲁兰酶基因序列,从实验室保藏的蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus GXBC-3中克隆得到3个普鲁兰酶基因pulA、pulB、pulC,并分别导入大肠杆菌进行胞内诱导表达。纯化重组酶酶学性质研究表明重组酶PulA能水解α-l,6-和α-l,4-糖苷键,为Ⅱ型普鲁兰酶,以普鲁兰糖为底物时,最适反应温度及pH分别为40℃和6.5,比活力为32.89 U/mg;以可溶性淀粉为底物时,最适反应温度及pH分别为50℃和7.0,比活力为25.71 U/mg。重组酶PulB和PulC二者均只能水解α-l,6-糖苷键,为I型普鲁兰酶,以普鲁兰糖为底物时,其最适反应温度及pH分别为45℃、7.0和45℃、6.5,比活力分别为228.54 U/mg和229.65 U/mg。     

一个新型耐热普鲁兰酶的结构与功能

新型普鲁兰酶的研究对于普鲁兰酶制剂的国产化、打破国外垄断具有非常重要的意义。从我国云南腾冲地区轮马热泉的淤泥中分离获得了一株耐热普鲁兰酶产生菌LM 18-11,经16S rDNA序列系统进化树分析,确定该菌为厌氧芽胞杆菌Anoxybacillus属种,并从中克隆获得了耐热普鲁兰酶的编码基因,该酶在55℃-60℃、pH 5.6-6.4的范围内具有最大的反应活性。此外,该酶具有较好的热稳定性,在60℃下处理48 h,仍可保持50%以上的活力;动力学分析该酶的Vmax和Km分别为750 U/mg和1.47 mg/mL,是目前文献报道中比活力最高的耐热普鲁兰酶。同时还对该酶进行了晶体结构分析,结果显示该酶具有?-淀粉酶家族中典型的结构,在N端具有一个特殊的底物结合域,该结构域的缺失导致比活力和底物结合力都有相应降低,Vmax和Km分别为324 U/mg和1.95 mg/mL。同时,将该普鲁兰酶编码基因导入枯草芽胞杆菌中,在P43启动子的控制下,普鲁兰酶基因获得了高效表达,胞外酶活可达42 U/mL,相比初始菌种,表达活力提高40倍以上。研究表明该普鲁兰酶具有很好的应用前景。     

地衣芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因的鉴定

对地衣芽孢杆菌基因组序列分析显示。其中标注为amyX的基因可能编码普鲁兰酶。以PCR方法,从地衣芽孢杆菌染色体DNA中扩增出amyX基因蛋白编码区,插入大肠杆菌表达载体pET28aT7启动予下游。含重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG诱导下表达出有活性的普鲁兰酶。酶学性质初步分析表明,重组普鲁兰酶最适反应温度为40℃,最适pH值为6．0。     

产普鲁兰酶菌株ZDJ35的分离鉴定及产酶特性

分别以支链淀粉和普鲁兰糖为唯一碳源,从烟草甲(Lasioderma serricorne)肠道中分离得到了一株活性较高的产普鲁兰酶菌株,编号为ZDJ35。该菌株在普鲁兰糖产酶培养基上32℃发酵50 h时,酶活性达到最大值4.25 U/m L。综合形态观察、生理生化分析和16S r DNA保守序列分析,确定菌株ZDJ35隶属于分枝杆菌属Mycobacterium,命名为Mycobacterium sp.ZDJ35。菌株ZDJ35具有较高的初始产普鲁兰酶活性,是良好的常规诱变育种和全基因组育种的备选出发菌株,应用潜力较大。     

嗜热地芽胞杆菌(Geobacilluskaustophilus)DY115普鲁兰酶基因的克隆、表达和酶学性质

采用基因工程方法对嗜热地芽胞杆菌(Geobacillus kaustophilus)DY115的普鲁兰酶基因pulA在大肠杆菌中进行了克隆表达。该基因ORF全长为2 157bp,编码718个氨基酸。重组PulA在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中能够有效表达,经Ni-Sepharose亲和层析获得纯化的重组PulA蛋白。PulA最适作用温度为70℃,最适pH为8.0,在65℃和碱性条件下具有良好的热稳定性;K+和Mn2+对PulA活性有明显促进作用,Cu2+和Zn2+则强烈抑制PulA活性;PulA对普鲁兰糖水解能力最强,且其水解支链淀粉和糯米淀粉的能力明显高于直链淀粉;PulA可水解普鲁兰糖的α-(1,6)糖苷键生成麦芽三糖,属于I型普鲁兰酶。这是首次对来源于地芽胞杆菌属(Geobacillus)的高温碱性普鲁兰酶进行报道,由于PulA具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好。     

嗜热地芽胞杆菌(Geobacillus kaustophilus)DY115普鲁兰酶基因的克隆、表达和酶学性质

采用基因工程方法对嗜热地芽胞杆菌(Geobacillus kaustophilus)DY115的普鲁兰酶基因pulA在大肠杆菌中进行了克隆表达。该基因ORF全长为2 157bp,编码718个氨基酸。重组PulA在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中能够有效表达,经Ni-Sepharose亲和层析获得纯化的重组PulA蛋白。PulA最适作用温度为70℃,最适pH为8.0,在65℃和碱性条件下具有良好的热稳定性;K~+和Mn~(2+)对PulA活性有明显促进作用,Cu~(2+)和Zn~(2+)则强烈抑制PulA活性;PulA对普鲁兰糖水解能力最强,且其水解支链淀粉和糯米淀粉的能力明显高于直链淀粉;PulA可水解普鲁兰糖的α-(1,6)糖苷键生成麦芽三糖,属于I型普鲁兰酶。这是首次对来源于地芽胞杆菌属(Geobacillus)的高温碱性普鲁兰酶进行报道,由于PulA具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好。     

产酸克雷伯氏菌M5al普鲁兰酶的异源表达及酶学性质研究

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是一类淀粉脱支酶,能够特异性水解淀粉中的α-1,6-糖苷键,从而提高淀粉的利用率,在以淀粉为原料的食品、纺织、生物燃料和洗涤剂等行业中具有重要的应用价值。本研究以产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca M5al基因组DNA为模板,将PCR扩增得到的普鲁兰酶基因pul A克隆至表达载体p ET28a(+),构建好的重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),在培养基中添加0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的条件下对该酶基因进行诱导表达,经镍柱纯化获得重组普鲁兰酶用于酶学性质研究。SDS-PAGE及Western Blot检测显示普鲁兰酶基因pul A在上述大肠杆菌宿主中成功获得了表达。该重组酶最适反应p H5.5,最适温度60℃。金属离子对酶活性有一定影响。Mn2+对酶活促进作用显著;Fe3+、Mg2+、Fe2+对酶活只有微弱的促进作用,而Cu2+对酶活造成强烈抑制。来源于Klebsiella oxytoca M5al的普鲁兰酶最适催化条件符合工业生产中淀粉糖化工艺的要求,具有应用于淀粉工业的潜力。     

普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达

根据文献报道的核苷酸序列合成Bacillus deramificans普鲁兰酶成熟肽编码基因BdP。将BdP基因插入芽孢杆菌分泌表达载体pUC980信号肽编码区下游,获得重组质粒pUC980-BdP,重组质粒转化中温α-淀粉酶生产菌解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株。摇瓶发酵实验表明,重组转化子发酵液有明显普鲁兰酶酶活,约48h酶活达到最高水平,为2．8ASPU／mL。酶学性质分析表明,重组酶最适作用温度约为60℃,最适反应pH为5．0,60℃保温3h仍保存50％的活性。重组酶性质适合淀粉糖化工艺的要求。     

Secreted expression of the pullulanase in Bacillus amyloliquefaciens BF7658

根据文献报道的核苷酸序列合成Bacillus deramificans普鲁兰酶成熟肽编码基因BdP.将BdP基因插入芽孢杆菌分泌表达载体pUC980信号肽编码区下游,获得重组质粒pUC980-BdP,重组质粒转化中温α-淀粉酶生产菌解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株.摇瓶发酵实验表明,重组转化子发酵液有明显普鲁兰酶酶活,约48 h酶活达到最高水平,为2.8 ASPU/mL.酶学性质分析表明,重组酶最适作用温度约为60℃,最适反应pH为5.0,60℃保温3h仍保存50％的活性.重组酶性质适合淀粉糖化工艺的要求.