猪口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及序列分析

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的决定因素。研究发现,至少有四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8是口蹄疫病毒(FMDV)的受体,其中αv是4种受体的通用亚基。首次从口蹄疫病毒实验感染猪的肺组织中克隆到了通用亚基αv基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪αv亚基基因的编码区含有3141个核苷酸,编码1046个氨基酸,其N-端30个氨基酸为信号肽,其后的胞外域、跨膜区、胞浆域分别由955、29、32个氨基酸组成;胞外域含有11个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)、2个Ca²⁺结合位点(DX［D/N］XDGXXD)、18个半胱氨酸残基。猪αv基因与牛、人、猕猴、家鼠、鸡、犬的αv基因的核苷酸序列同源性分别为93.3%、91.5%、91.4%、85.6%、73.2%、89.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.3%、94.6%、94.1%、90.8%、81.6%、93.8%,猪与牛αv亚基同源性最高,表明受体αv亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

猪口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及序列分析

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的决定因素。研究发现,至少有四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8是口蹄疫病毒(FMDV)的受体,其中αv是4种受体的通用亚基。首次从口蹄疫病毒实验感染猪的肺组织中克隆到了通用亚基αv基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪αv亚基基因的编码区含有3141个核苷酸,编码1046个氨基酸,其N-端30个氨基酸为信号肽,其后的胞外域、跨膜区、胞浆域分别由955、29、32个氨基酸组成;胞外域含有11个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)、2个Ca2 结合位点(DX[D/N]XDGXXD)、18个半胱氨酸残基。猪αv基因与牛、人、猕猴、家鼠、鸡、犬的αv基因的核苷酸序列同源性分别为93.3%、91.5%、91.4%、85.6%、73.2%、89.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.3%、94.6%、94.1%、90.8%、81.6%、93.8%,猪与牛αv亚基同源性最高,表明受体αv亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

棉铃虫腺苷酸转移酶基因的克隆与分析

腺苷酸转移酶(ANT)是线粒体内膜上负责能量分子传导的转运蛋白, 在细胞凋亡调控网络中有重要作用。本研究以棉铃虫幼虫组织的mRNA为模板, 根据鳞翅目昆虫ant基因编码区保守序列设计引物, 进行RT-PCR分析, 同时结合5′、3′ RACE方法扩增出棉铃虫ant基因的全长cDNA序列, cDNA全长为1 190 bp (GenBank登录号AY253868), 具有完整的开放阅读框架(ORF, 133~1 033 bp), 编码蛋白为300个氨基酸, 其中N端22个氨基酸为信号肽, 引导ANT蛋白定位于线粒体内膜。该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域, 形成能量分子传导的转运通道, 催化细胞质中ADP和线粒体内ATP间进行跨膜交换。通过与其他昆虫的腺苷酸转移酶蛋白序列比较, 发现该基因具有高度的保守性, 氨基酸序列同源性都在90%左右。     

绞股蓝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

目的:克隆并分析绞股蓝法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因的全长序列。方法:参照罗汉果法呢基焦磷酸合酶基因,设计扩增绞股蓝FPS基因的3′RACE引物,采用3'RACE和5'RACE法克隆绞股蓝FPS基因全长cDNA。结果:获得绞股蓝FPS基因全长cDNA序列共1288个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放读框,编码342个氨基酸残基,推断该蛋白的相对分子质量为3.94×104。NCBI Blast结果显示绞股蓝FPS基因编码蛋白的氨基酸序列与已知的植物FPS氨基酸序列的同源性为91%~74%,核酸序列的同源性为88%~78%。结论:克隆了绞股蓝FPS基因全长cDNA序列,为进一步研究绞股蓝FPS基因的表达及三萜皂苷合成通路关键酶分子的进化奠定了基础。     

莴苣花叶病毒浙江余杭分离物基因组全序列及其结构分析

测定了莴苣花叶病毒(LMV)浙江余杭分离物基因组全序列.此病毒分离物基因组由10*!080个核苷酸组成,具典型的马铃薯Y病毒科成员基因组结构,与已报道的欧洲、美国和巴西LMV核苷酸同源性为96.7%～98.8%,氨基酸同源性97.8%～99.0%.根据外壳蛋白氨基酸序列和5′端非编码区核苷酸序列分析比较及分子进化树分析,可将全球LMV分为西欧-加利福尼亚、希腊和也门3个类群.LMV有可能起源于加利福尼亚州向西欧,进而向希腊和也门扩展,浙江余杭LMV有可能来源于加利福尼亚州和西欧.     

梅花鹿卵泡刺激素α-亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的母梅花鹿脑垂体中提取总RNA,反转录获得CDNA,以此CDNA为模板用PCR法扩增目的片段,获得长为380bp的梅花鹿卵泡刺激素α-亚基CDNA片段,它将克隆至PMD-18-T-Verctor。随机挑选3个阳性重组子进行测序,并将测序结果与绵羊、牛、猪等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较。结果表明,梅花鹿卵泡刺激素α-亚基基因编码的氨基酸序列与绵羊、水牛的该基因同源性最高,达97%,只有4个氨基酸不同;与牛的该基因同源性达96%。与人的该基因氨基酸序列同源性较低,为75%。其编码的核苷酸序列与绵羊、水牛、牛的同源性最高,达96%,只有14-16个碱基不同,与人的基因核苷酸同源性最低,为84%,总的来说,哺乳动物的卵泡刺激素α-亚基具有很高的同源性。     

鸡二价金属转运蛋白1 cDNA的克隆与序列分析

鸡二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1, DMT1）在动物胃肠道锰吸收过程中起重要作用.根据哺乳动物Dmt1同源蛋白氨基酸序列的保守性设计引物，应用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术，扩增并克隆获得鸡小肠Dmt1 cDNA 3′端1 289bp和1 092bp的2种片段，发现其3′端翻译区和非翻译区存在差异. 根据鸡Dmt1 cDNA 3′端片段的测序结果设计引物，扩增获得1个与3′端片段部分重叠的鸡Dmt1 cDNA 5′端907 bp片段，并对其进行了克隆测序. 根据鸡小肠Dmt1 3′RACE片段和5′RACE片段序列信息进行拼接，从而获得鸡小肠Dmt1 cDNA全序列信息.结果表明，鸡小肠Dmt1 cDNA有2种形式，1种全长为1 972个核苷酸，其中5′非翻译区为104个核苷酸，编码区1 695个核苷酸，3′非翻译区为173个核苷酸，编码1个含564个氨基酸残基的蛋白质；另1种形式为1 775个核苷酸，其中5′非翻译区为104个核苷酸，编码区1 593个核苷酸，3′非翻译区为78个核苷酸，编码1个含530个氨基酸残基的蛋白质.据鸡Dmt1 cDNA推测出的2种形式蛋白质的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的Dmt1蛋白具有高度同源性，它们的同源性分别为82%、82%、80%,和 84%、84%、83%. 对推测氨基酸序列进行疏水性和跨膜区分析表明，Dmt1蛋白为1种跨膜整合蛋白，具有膜转运蛋白糖基化位点和底物结合位点的保守序列.     

番木瓜环斑病毒华南强株系cDNA文库的构建及其基因组3'端区域结构的研究

以λ-ZAPⅡ噬菌体为载体,构建了番木瓜环斑病毒华南强株系(PRV-SM)基因组cDNA文库。以PCR扩增的外壳蛋白(CP)基因为探针筛选出阳性克隆。酶谱和序列分析确定,其中两个阳性克隆除重叠部分外为长达2676个核苷酸的基因组3′端区域。其中包括棱内含体蛋白b(NIb)基因的1607个棱苷酸,CP基因的858个核苷酸和基因组3′端非编码区的211个核苷酸(不包括polyA尾巴)。PRV-SM的NIb含有依赖于RNA的RNA聚合酶的8个特征性保守序列,可能是参与基因组RNA复制的核心亚基。与其他株系比较,NIb的氨基酸变化主要集中在其C端和N端。PRV-SM 3′端非编码区有一段28个核苷酸的正向重复序列,能在其内形成茎环二级结构,并且在各株系间具有高度保守性。NIb,CP和3′端非编码区的总的序列比较表明,SM株系与国外报道的其他株系亲缘关系相对较远。     

中国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30基质蛋白基因和融合蛋白基因的分子特征分析

对我国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30进行基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因序列测定,并进行分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应扩增出M和F基因片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析。China/Tib/Gej/07-30的M基因由1483个核苷酸组成,编码335个氨基酸,与其他分离株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.4%～97.7%和97.0%～98.2%。F基因由2411个核苷酸组成,编码546个氨基酸,与其他分离株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为85.5%～96.1%和94.3%～98.2%。China/Tib/Gej/07-30的F蛋白含有信号肽序列和跨膜结构域,序列高度变异。F蛋白第104～108位和第109～133位氨基酸位点分别是高度保守的裂解位点和融合肽结构域。F蛋白还含有序列高度保守的三个七肽重复区。China/Tib/Gej/07-30的M基因3′端的非编码区(UTR)长度为443个核苷酸,GC含量高达68.4%,与其他PPRV毒株的同源性为82.4%～93.5%。China/Tib/Gej/07-30的F基因5′UTR区长度为634个核苷酸,GC含量高达70.0%,与其他PPRV毒株序列相似性为76.2%～91.7%。     

暗纹东方鲀线粒体COⅡ及两侧tRNA基因的克隆和序列分析

用细胞色素氧化酶第二亚基基因(COⅡ)特异性引物对暗纹东方(Takifugu fasciatus)的线粒体DNA(mtDNA)进行PCR扩增,克隆并测定了COⅡ及其侧翼tRNA基因的全序列,结果显示,COⅡ基因691 bp和5′端上游的tRNAAsn基因及3′端下游的tRNALys基因序列共890 bp。用DNA分析软件比较暗纹东方与GenBank中9个目11种鱼类的COⅡ序列,显示暗纹东方与这些鱼类的COⅡ基因具有较高的同源性;其中与同属红鳍东方(T.rubripes)的同源性最高为99.0%。暗纹东方COⅡ基因的核苷酸组成中,A T含量为56%,与其他11种鱼类的A T含量(55%~62%)相近。鱼类COⅡ序列组成对A T核苷酸的偏倚程度比较低。根据暗纹东方与其他11种鱼的COⅡ基因序列同源性所建立的分子进化树,与传统的分类地位基本吻合。推定的tRNA二级结构为典型的三叶草型结构。     

Cloning, Nucleotide Sequences and Differential Expression of the nifH and nifH-Like (frxC) Genes from the Filamentous Nitrogen-Fixing Cyanobacterium Plectonema boryanum

The frxC gene, found in liverwort chloroplast DNA, encodes aprotein of unknown function. The deduced amino acid sequenceof the protein shows significant homology to that of ni-trogenaseFe-protein encoded by the nifH gene. We have cloned the frxCand nifH genes from the nitrogen-fixing cyanobacterium Plectonemaboryanum, using frxC- and nifH-specific probes, and have determinedtheir nucleotide sequences. The amino acid sequence deducedfrom the frxC gene of P. boryanum exhibits 83% homology to thatof the protein encoded by the/rxCgene from liverwort, whereasit exhibits only 34% homology to that encoded by the nifH genefrom the same organism, namely, P. boryanum. Northern blot analysisshowed that the frxC gene was transcribed more actively undernitrogenase-repressed conditions than under nitrogenase-inducedconditions, suggesting that the FrxC protein has a functiondistinct from nitrogen fixation. These results, together withthe phylogenetic relationship between the nifH and frxC genes,indicate that the frxC and nifH genes are derived from a commonancestral gene but have evolved independently to encode proteinswith different functions. (Received April 27, 1991; Accepted August 12, 1991)     

家蚕MYST组蛋白乙酰转移酶基因Bm-mof的克隆表达和转录活性检测

MYST组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)广泛存在于从酵母到人的真核生物中,在真核生物的转录调控中起着重要的作用。利用NCBI已登录的其他物种该基因的氨基酸序列与家蚕的基因组框架图和表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库进行电子克隆,获得了家蚕中的同源基因。该基因长1 575 bp（GenBank登录号为DQ442997）,开放阅读框(ORF)长1 326 bp,无内含子。基因编码442个氨基酸,预测蛋白质的分子量为51.4 kD。序列中有HAT核心结构域、锌指结构域和染色质域3个保守的结构域,与其他物种同源基因具有较高的序列相似性。RT-PCR结果表明该基因在本实验所检测的家蚕各时期和组织中均有表达。将该基因用亚克隆的方法导入到pET50b载体中并成功地进行了原核表达,表达出了带有6个组氨酸和1个Nus·Tag标签的重组蛋白。     

甜菜夜蛾泛素延伸蛋白基因cDNA的3′RACE-PCR扩增及其克隆和表达

根据已知的草地夜蛾Spodoptera frugiperda的泛素延伸基因 5'端核苷酸序列设计引物,应用3'RACE-PCR技术,从甜菜夜蛾S. exigua脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素基因的cDNA片段。扩增得到的片段全长513 bp,3'末端有123 bp的非翻译区,翻译区编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质,预测分子量为14.8 kD。同源分析表明,此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53) 基因,在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白（ribosomal L40 protein）。用MagAlign和Genedoc软件对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析,结果表明： 甜菜夜蛾的ubi-53基因与真核生物家蚕Bombyx mori、草地夜蛾、果蝇Drosophila melanogaster和人Homo sapienes泛素的同源性分别为96.9%、98.5%、95.3%和93.0%,与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)泛素的同源性为78.8%,说明真核生物的泛素基因与核型多角体病毒的泛素基因可能存在不同的分子进化途径。将甜菜夜蛾的ubI-53基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化至BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,用异源泛素单克隆抗体进行Western blot检测,证明原核表达蛋白是目的蛋白。     

拟黑多刺蚁雌激素相关受体基因cDNA的克隆及生物信息学分析

雌激素相关受体（estrogen related receptors, ERRs）能够直接与类固醇激素受体共激活子（steroidhormone receptor coactivator,SRC）结合,激活靶基因的表达,与众多生理和发育过程有关.采用RT-PCR、RACE等方法从拟黑多刺蚁Polyrhachis vicina Roger克隆得到了雌激素相关受体基因的cDNA克隆,命名为pvERR （GenBank 登录号为EF474463）,并采用生物信息学方法对其cDNA和编码的蛋白质的理化性质、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行了预测和推断.结果表明：pvERR基因cDNA全长1 935 bp,包含一个1 305 bp的开放阅读框、245 bp的5′-UTR 和385 bp的3′-UTR,编码一个由434个氨基酸组成的蛋白质.pvERR的配体结合区（ligand binding domain,LBD）主要由两个β折叠和11个α螺旋（H1, H3～H12, 缺少H2）构成,这与哺乳类动物已知晶体结构的ERR_γ的配体结合区结构非常相似.pvERR氨基酸序列与其他昆虫ERRs氨基酸序列同源性很高,它与西方蜜蜂Apis mellifera雌激素相关受体amERR氨基酸序列相似性达到89.9 %;在进化关系上,pvERR与人类Homo sapiens ERRs的关系比果蝇Drosophila melanogaster雌激素相关受体dERR与人类的更近.本文可为进一步研究pvERR在昆虫发育中的功能提供有价值的信息.     

Nucleotide sequence of the virG locus of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58

The nucleotide sequence of the virG locus of the nopaline type plasmid pTiC58 of Agrobacterium tumefaciens has been determined. It contains an open reading frame (ORF) of 759 nucleotides and has 77% homology to the virG sequences of octopine type plasmids. Differences between the sequences of the two types of Ti plasmids in the region of virG are located predominantly outside the ORF. The amino acid sequences inferred from the two virG genes show 80% homology to each other and each shows the same moderate homologies to amino acid sequences derived from genes in a family of two-component regulatory systems. Specific differences in nucleotide and amino acid sequences as well as a structure-function model for the gene product are discussed.     

The Amino Acid Sequence of Ascorbate Peroxidase from Tea Has a High Degree of Homology to That of Cytochrome c Peroxidase from Yeast

The chloroplast isozyme of ascorbate peroxidase from tea leaveswas digested with lysyl endopeptidase, and the amino acid sequencesof the peptide fragments were determined. These sequences accountedfor 64% of the amino acids in the entire protein. The sequenceof one of the peptides can be aligned with the region whichincludes the proximal histidine that serves as the fifth ligandof the heme iron in guaiacol peroxidases and cytochrome c peroxidase.The sequences of the peptides from ascorbate peroxidase exhibita higher degree of homology to the sequence of cytochrome cperoxidase from yeast than to those of guaiacol peroxidasesfrom plants. In addition, three of the peptides from ascorbateperoxidase show a high degree of homology to triose-phosphateisomerase from maize. From the available amino acid sequencesand the enzymatic and molecular properties of ascorbate andcytochrome c peroxidases, we propose that these hydrogen peroxide-scavengingperoxidases that use either cytochrome c or ascorbate as theelectron donor originated from the same ancestral protein. (Received July 5, 1991; Accepted December 6, 1991)     

Genetic Architecture of Physiological Phenotypes: Empirical Evidence for Coadapted Gene Complexes

Physiological phenotypes are the result of the coordinated functionof many genes, some of which may be differentiated between conspecificpopulations. Within any one population, natural selection willfavor evolution of a coadapted set of alleles which optimizesphysiological performance and reproductive success. The existenceof such coadapted gene complexes may be assessed by assayingphenotypes of interpopulation hybrids: inferior performanceof hybrids suggests that the allelic combinations present inthe parental populations are coadapted. This approach has beenused to examine the genetic architecture of physiological traitsin the copepod Tigriopus californicus, a species characterizedby sharp genetic differentiation of populations. Developmentaltime and response to osmotic stress both show pronounced F₂hybrid breakdown, a result consistent with genetic coadaptationwithin populations. To better understand the biochemical andmolecular mechanisms underlying hybrid breakdown, we are investigatinga specific biochemical phenotype, the activity of the enzymecytochrome c oxidase (COX). COX (encoded by multiple nuclearand mitochondrial genes) catalyzes the oxidation of cytochromec (encoded by a nuclear gene). Two approaches are being usedto address the extent of coadaptation (both among nuclear genesand between nuclear and mitochondrial genes) underlying COXfunction: (1) studies of the DNA (and inferred amino acid) sequencesof component genes among populations in search of coordinatepatterns of amino acid substitution across loci, and (2) directstudies of COX function in interpopulation hybrids and backcrosses.These approaches provide evidence for the existence of nuclear/nuclearand/or nuclear/mitochondrial coadaptation within natural populationsof T. californicus.     

一个新的家蚕转录相关锌带蛋白基因的克隆及序列分析

锌带蛋白(zinc ribbon protein )是锌指类蛋白的一种,它的Cys4 Zn(2+)结合位点由3个β₂片层折叠而成,而不是α螺旋结构。锌带结构与锌指结构同为转录因子结合核酸的结构域,锌带蛋白作为转录相关因子在调节基因表达活性等方面具有重要作用。在对家蚕 Bombyx mori蛹cDNA文库测序中,发现一个新的编码家蚕锌带蛋白基因的EST序列（GenBank 登录号DY230964）,以此序列为信息探针检索家蚕EST数据库,通过同源筛选,获得一个新的家蚕锌带蛋白基因cDNA全序列并经RT-PCR检测和克隆、测序验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。我们将其命名为 BmZNRD1 (Zinc Ribbon Domain Containing 1)（GenBank登录号DQ432055）。该基因全长为675 bp,由363 bp的开放阅读框序列(ORF)、10 bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)和302 bp 的3′端非编码区序列(3′ UTR)组成,其编码的120个氨基酸序列与其他真核生物间具有较高的同源性（达60%左右）,预测分子量为13.54 kD, 等电点为6.8。BmZNRD1编码的氨基酸序列是一种锌带蛋白,推测有2个功能结构域,分别是位于N-端的Cx₂Cx₁₄Cx₂C和C-端的Cx₂Cx₂₄Cx₂C,其中C-端保守氨基酸序列Cx₂Cx₆Yx₃QxRSADEx₂TxFx₂Cx₂C在生物进化中保守性很高,从酵母、果蝇、线虫到两栖类、哺乳类都有发现该结构域的存在,与酵母RNA聚合酶A亚单位9和转录相关蛋白有很高的相似性,推测其具有相同的功能。将BmZNRD1基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有3个外显子,2个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。 关键词： 家蚕; 锌带蛋白基因; 电子克隆; 基因克隆; 序列分析     

Isolation and characterization of plant genes coding for acetolactate synthase, the target enzyme for two classes of herbicides

Acetolactate synthase (ALS) is the first common enzyme in the biosynthetic pathways to valine, isoleucine, and leucine. It is the target of two structurally unrelated classes of herbicides, the sulfonylureas and the imidazolinones. Genomic clones encoding ALS have been isolated from the higher plants Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum, using a yeast ALS gene as a heterologous hybridization probe. Clones were positively identified by the homology of their deduced amino acid sequences with those of yeast and bacterial ALS isozymes. The tobacco and Arabidopsis ALS genes have approximately 70% nucleotide homology, and encode mature proteins which are approximately 85% homologous. Little homology is seen between the amino acid sequences of the presumptive N-terminal chloroplast transit peptides. Both plant genes lack introns. The tobacco ALS gene was isolated from a line of tobacco which is resistant to the sulfonylurea herbicides due to an alteration in ALS. The tobacco gene which was isolated codes for an ALS that is sensitive to the herbicides, as assayed by transformation of the gene into sensitive tobacco cells.