花生温度诱导载脂蛋白基因AhTIL1的克隆和表达研究

温度诱导的载脂蛋白(temperature induced lipocalins,TILs)与植物在热、冷、光、氧化等胁迫下的稳定性相关,旨在克隆花生中的温度诱导的载脂蛋白基因,分析其在响应低温、高温中的作用。从花生c DNA文库中筛选到一个TIL候选基因,命名为Ah TIL1,通过PCR扩增获得了其基因组和候选启动子的序列,并利用实时定量PCR等方法检测了该基因在花生不同组织、种子不同发育时期和温度胁迫下的相对表达量。序列分析结果表明,该基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为558 bp,编码185个氨基酸。生物信息学分析显示,推测的Ah TIL1蛋白质相对分子质量为21.4 k D,等电点为6.78。序列比对结果显示,该蛋白氨基酸序列同其他物种TIL蛋白显示出很高的同源性。对候选启动子预测结果表明,该基因的候选启动子包含ACE、Box4、G-box、GAG-motif等与光反应相关的调控元件以及与ABA、水杨酸、赤霉素、厌氧等相关的顺式调控元件。基因芯片和RNASeq结果表明,该基因在花生的根、茎、叶、花、果针、种子中均有表达,在花中表达量最高,茎中次之,在根中表达量最低;Ah TIL1在果针入土后表达量下降,随着荚果的膨大和种子的成熟,Ah TIL1的表达量逐渐增加。实时定量PCR结果证明,Ah TIL1在高温和低温诱导3、6、12和24 h后上调表达,在48 h后表达量下降。Ah TIL1可能在花生响应低温、冷胁迫中发挥着重要的作用。     

斑节对虾金属硫蛋白基因cDNA克隆与表达分析

采用RACE-PCR方法从斑节对虾(Penaeus monodon)总RNA反转录产物中获得了502 bp的金属硫蛋白(Pm-MT)基因cDNA序列。该序列包含69 bp 的5非编码区(UTR)和256 bp 的3非编码区(UTR)以及177 bp的开放阅读框(ORF), 可编码58个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸含量丰富, 不含芳香族氨基酸, 存在有无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX, 预测的分子量约为6.05 kD, 理论等电点7.75。序列比对分析表明Pm-MT与北美淡水蟹(Pacifastacus leniusculus)的相似性高达91.4%, 与美国龙虾(Homarus americanus)的同源性最高为84.5%。实时定量PCR显示在所检测组织中, Pm-MT的mRNA在卵巢的表达量最高, 其次为胃、肠、心脏、脑和肝胰腺; Pm-MT的mRNA在斑节对虾6个不同发育期的卵巢中的表达量都很高, 其中在Ⅱ期卵巢中的表达量最高。实验所得结果以期为Pm-MT进一步在卵巢发育的功能研究提供基础材料。       

凡纳滨对虾MT基因序列及其在卵巢发育和低温胁迫中的表达分析

在低温处理仔虾全长cDNA文库的筛选测序中, 获得凡纳滨对虾(Litopenaeus vannmei)金属硫蛋白基因全长cDNA序列, 该序列含有425个碱基, 包含177 bp开放阅读框, 上游98 bp的非编码区及下游150 bp 的非编码区, 编码58个氨基酸, 其中半胱氨酸含量丰富, 富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys 结构。多序列比对表明, 凡纳滨对虾MT蛋白序列与美洲螯龙虾(Homarus americanus)MT蛋白序列具最高同源性72.4%。Real-time PCR结果表明, 凡纳滨对虾MT基因在卵巢组织中呈优势表达, 在不同发育期的卵巢中的表达量都很高, 在低温处理凡纳滨对虾肝胰腺组织中上调表达。实验所得结果为研究凡纳滨对虾金属硫蛋白基因在生殖发育和低温应激中的功能提供了参考。       

一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达

采用RACE技术克隆得到一个新的忽地笑O-甲基转移酶（OMT）基因,命名为LaOMT。LaOMT的cDNA序列为1379 bp,开放阅读框1077 bp,预测编码蛋白包含358个氨基酸。序列比对分析发现, LaOMT编码的蛋白序列具有依赖于S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的高度保守的结构域,与葡萄、大豆等其他植物OMTs蛋白的相似性为50%左右。将LaOMT基因连接到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌Rosetta （DE3）的SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白受异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,分子量大小约为45 kDa,与已报导的其他植物的OMTs蛋白大小基本一致。此外,半定量RT-PCR分析结果表明, LaOMT在忽地笑的叶、鳞茎、根和花中均有表达,其中花中的表达量最低。     

小蓬NeMT2基因的克隆及其植物表达载体的构建

该研究利用RACE ( Rapid amplification of cDNA ends)技术从小蓬中成功分离编码金属硫蛋白( Metal-lothionein,MT)的cDNA序列,命名为NeMT2,在GenBank中登录号为KT835290。该基因全长590 bp,开放阅读框为237 bp,编码78个氨基酸,编码的氨基酸序列中含有14个半胱氨酸残基( Cys,C),呈C-C,C-X-C,C-X-X-C排列,集中分布在肽链的N端和C端,基因编码蛋白的分子量为7.6036 kD,等电点为4.71。系统发育分析表明,小蓬金属硫蛋白NeMT2与藜科的海蓬子( AEF01492)和盐穗木( AHI62953)同源性最高,其次是甜菜( XP 010667708.1)。生物信息学分析表明,金属硫蛋白NeMT2无信号肽结构,属于非跨膜亲水性蛋白;疏水性分析表明,NeMT2蛋白的35~45个氨基酸之间有较强的疏水性,其中第41位Asp具最强的疏水性(1.444);结构预测分析该蛋白质二级结构的主要元件是无规则卷曲。通过RT-PCR对NeMT2基因的表达分析发现, NeMT2基因在铜矿区和非铜矿区的小蓬叶片中均有表达,但该基因在铜矿区小蓬叶片的表达量明显高于非铜矿区。将小蓬NeMT2基因定向克隆到植物表达载体pCAMBIA1300的35S 启动子下游,构建该基因的植物超表达载体pCAMBIA1300＋NeMT2。该研究结果为进一步研究该基因的功能和小蓬响应重金属胁迫的分子机制提供了一定基础。     

菊芋类金属硫蛋白基因htMT2的克隆及其表达特征分析

从菊芋 (HelianthustuberosusL .)块茎cDNA文库中得到了一个新的植物类金属硫蛋白基因htMT2的cDNA序列 ,全长 5 0 9bp ,包括 2 4 0bp的开放阅读框、6 2bp的 5′端非翻译区、2 0 7bp的 3′端非翻译区。通过PCR获得了 2个htMT2编码区的部分基因组片段htMTG_1及htMTG_2 ,长度分别为 986bp和 982bp。分析表明两个基因组片段均包含 3个外显子及 2个内含子 ,编码一个由 79个氨基酸残基组成的多肽 ,与从htMT2推测的多肽完全一致 ,该多肽具有植物类金属硫蛋白的典型结构特征 ,N端及C端结构域富含Cys ,分别具有 8个和 7个Cys残基 ,上述两个结构域被一个无Cys的中间区分开。Southern杂交结果表明 ,htMT2在菊芋基因组中以小基因家族的形式存在。Northern杂交结果表明htMT2在叶片、叶柄、茎及块茎中均有表达 ,在茎中有较高水平的表达 ,但在根中未检测到杂交信号。经Cu2 处理后 ,htMT2在茎中的表达量显著降低。与其他 2型金属硫蛋白的序列同源性比较及htMT2对金属离子处理的反应均表明 ,htMT2是一种新的植物类金属硫蛋白基因。     

利用阵列分析水稻AP2/EREBP 家族基因的表达特性

AP2/EREBP蛋白是广泛存在于高等植物中的且包含AP2/EREBP功能域的重要转录因子家族, 通常可分为包含单功能域的EREBP类蛋白和包含两个功能域的AP2类蛋白, 它们的功能涉及植物生长发育调控和对逆境应答等许多方面。据预测,水稻基因组编码150个左右的AP2/EREBP 家族成员, 但目前绝大多数蛋白的功能仍不清楚。为了解这些基因在水稻不同器官中的表达特性, 我们以AP2/EREBP功能域的氨基酸序列为基础, 从水稻基因组数据库中搜索到12个AP2类以及20个EREBP类预测基因, 利用PCR扩增的编码区序列制备了这些预测基因的macro-array。 以幼芽、幼根、幼叶、颖花和灌浆期成熟叶的 cDNA为探针, 杂交分析结果显示: 不同AP2类预测基因之间的表达量差别较大, 但同一个基因在不同器官中表达量基本一致; 与此不同的是, 大部分EREBP类预测基因在幼根和成熟叶片中表达量较高, 而在幼芽和幼叶中表达量较低。这些预测基因的表达模式可能与它们的功能密切相关。     

菊芋类金属硫蛋白基因htMT2的克隆及其表达特征分析

从菊芋(Helianthus tuberosus L.)块茎cDNA文库中得到了一个新的植物类金属硫蛋白基因htMT2的cDNA序列,全长509 bp,包括240 bp的开放阅读框、62 bp的5′端非翻译区、207 bp的3′端非翻译区.通过PCR获得了2个htMT2编码区的部分基因组片段htMTG-1及htMTG-2,长度分别为986 bp和982 bp.分析表明两个基因组片段均包含3个外显子及2个内含子,编码一个由79个氨基酸残基组成的多肽,与从htMT2推测的多肽完全一致,该多肽具有植物类金属硫蛋白的典型结构特征,N端及C端结构域富含Cys,分别具有8个和7个Cys残基,上述两个结构域被一个无Cys的中间区分开.Southern杂交结果表明,htMT2在菊芋基因组中以小基因家族的形式存在.Northern杂交结果表明htMT2在叶片、叶柄、茎及块茎中均有表达,在茎中有较高水平的表达,但在根中未检测到杂交信号.经Cu2+处理后,htMT2在茎中的表达量显著降低.与其他2型金属硫蛋白的序列同源性比较及htMT2对金属离子处理的反应均表明,htMT2是一种新的植物类金属硫蛋白基因.     

利用阵列分析水稻AP2/EREBP家族基因的表达特性

AP2／EREBP蛋白是广泛存在于高等植物中的且包含AP2／EREBP功能域的重要转录因子家族,通常可分为包含单功能域的EREBP类蛋白和包含两个功能域的AP2类蛋白,它们的功能涉及植物生长发育调控和对逆境应答等许多方面。据预测．水稻基因组编码150个左右的AP2／EREBP家族成员,但目前绝大多数蛋白的功能仍不清楚。为了解这些基因在水稻不同器官中的表达特性,我们以AP2／EREBP功能域的氨基酸序列为基础,从水稻基因组数据库中搜索到12个AP2类以及20个EREBP类预测基因,利用PCR扩增的编码区序列制备了这些预测基因的macro—array。以幼芽、幼根、幼叶、颖花和灌浆期成熟叶的cDNA为探针,杂交分析结果显示：不同AP2类预测基因之间的表达量差别较大,但同一个基因在不同器官中表达量基本一致：与此不同的是,大部分EREBP类预测基因在幼根和成熟叶片中表达量较高,而在幼芽和幼叶中表达量较低。这些预测基因的表达模式可能与它们的功能密切相关。     

蔓花生PEPC基因家族的生物信息学分析

为了解花生中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)的功能,对二倍体祖先种野生蔓花生(Arachis duranensis)基因组数据库进行分析,发现存在9个Ad PEPC基因家族成员,这些基因的序列长度为3 584~12 956 bp,开放阅读框(ORF)长度为702~3 168 bp,分布在3、5、7、8、9、10号染色体上。蔓花生Ad PEPC家族蛋白的氨基酸序列中均含有HCO3-结合位点和PEP结合位点等保守结构域,根据序列特征可分为植物型、细菌型和序列较短的PEPC等3类,同类蛋白序列的同源性较高,基因结构中的内含子与外显子的数目也较相似。基因表达分析表明,多数成员在花或茎中的表达量较高,Ad PEPC1;2和Ad PEPC4;2在茎中的表达量最高,其他家族成员尤其是Ad PEPC2、Ad PEPC1;5和Ad PEPC1;3在花中的表达量明显高于其他组织,Ad PEPC1;5基因在叶中不表达。Ad PEPC3在根、茎、叶和花中均不表达,推测该基因为假基因。这为深入研究Ad PEPC家族基因的功能奠定了基础。     

野生种马铃薯SpPHYB基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从野生种马铃薯中克隆到一个光敏色素基因PHYB,其cDNA全长为3470bp。含有一个3393 bp的完整开放阅读框,编码一条长1130个氨基酸的蛋白,分子量为125kDa,等电点为5.6。该基因编码的蛋白序列与栽培种马铃薯、番茄和烟草同源基因编码的氨基酸序列一致性分别为98%、95%、92%,命名为SpPHYB.半定量PCR分析表明,根、茎、叶和芽中SpPHYB表达水平较高且相似,但在花和块茎成熟器官中表达量稍低.     

Cloning of metallothionein genes from <Emphasis Type="Italic">Arachis hypogaea</Emphasis> and characterization of <Emphasis Type="Italic">AhMT2a</Emphasis>

Seven cDNA sequences putatively encoding metallothionein (MT) proteins were isolated from peanut (Arachis hypogaea L.). We analyzed the sequences of the deduced amino acids and characterized one of these genes, AhMT2a. Northern blot analysis indicates that the accumulation of AhMT2a mRNA was found in stems, young roots, and young leaves, and AhMT2a mRNA levels were up-regulated by cadmium, copper, ABA, H₂O₂, and heat shock. The metal-binding properties of the recombinant protein expressed in E. coli was investigated, and the results show that bacteria harboring AhMT2a exhibited increased tolerance to cadmium, copper, and lead, and the metal accumulation was also higher than the controls. Taken together, our results suggest that the AhMT2a protein might function in both detoxification of heavy metals and scavenging of reactive oxygen species in peanut. Published in Russian in Fiziologiya Rastenii, 2007, Vol. 54, No. 5, pp. 755–762. The text was submitted by the authors in English.     

小鼠金属硫蛋白 Ⅰ cDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ｐＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ｐＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确．再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ／Ｌ     

斧文蛤金属硫蛋白基因的克隆与表达分析

金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒、维持金属元素代谢平衡以及清除自由基等生理功能。为了解斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）的分子生物学特征及其在重金属Cd2+胁迫下的响应机制,本文采用RACE技术从斧文蛤（Meretrix lamarckii）总RNA反转录产物中获得了636 bp的Ml-MT cDNA基因序列。该序列包含65 bp的5非编码区（UTR）和340 bp的3非编码区（UTR）以及231 bp的开放阅读框（ORF）,可编码76个氨基酸;其中半胱氨酸占27%,不含芳香族氨基酸,含16个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构,预测的分子量约为7.704 kD,理论等电点7.138。MT氨基酸序列比对分析表明:斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）与丽文蛤（Meretrix lusoria）的相似性高达88%,与文蛤（Meretrix meretrix）的同源性为87%。实时荧光定量（qRT-PCR）检测MT在斧文蛤5种组织中均有表达,但存在组织特异性,其中内脏团表达量最高,其次依次为鳃丝、闭壳肌、外套膜、斧足。在Cd2+（0.13 mg/L）胁迫0、6h、12h、24h、48h、72h和96h下,斧文蛤内脏团MT呈现出不同程度的上调表达,具体表现为高-低-高-低的波浪式变化,除6h以外,其他时间点均与对照组存在极显著差异（P0.01）。本研究表明:MT基因在维护机体正常生理功能及斧文蛤抵御重金属Cd2+胁迫过程中发挥着重要的分子调控作用。     

甜荞FaesAP2基因的克隆与表达分析

本研究采用同源克隆和RACE技术,从甜荞（Fagopyrum esculentum Moench.）品种'西农9976'中分离出调控花器官发育的FaesAP2基因,该基因序列全长1668 bp,包含1个长为1374 bp的完整开放阅读框,共编码457个氨基酸。序列比对以及系统发育分析结果发现,FaesAP2蛋白拥有2个高度保守的AP2（APETALA2）结构域,在第1个AP2结构域前端有1段由10个氨基酸残基组成的高度保守的核定位信号区;系统发育分析显示其与拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.） Heynh.） AP2转录因子的亲缘关系较近。基因表达模式分析表明,该基因在甜荞pin型和thrum型花的雄蕊和雌蕊中有明显的表达,但在幼叶和花被片中不表达,且其表达量在2种类型花不同发育时期呈现明显的变化,均在花药迅速膨大期达到最高值,因此推测该基因在甜荞花发育过程中可能参与了花器官发育的调控。     

日本沼虾MT基因克隆、组织差异性表达及与饲料铜、锌含量的相关性

为了更全面理解日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的铜/锌营养生理作用,研究利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆获得一金属硫蛋白基因cDNA全长(mn-MT),并对该基因分子特征、组织表达谱和饲料铜/锌水平对其表达的影响进行分析。结果显示:(1)mn-MT cDNA全长665 bp,含编码59个氨基酸的180 bp的开放阅读框,预测该多肽的理论分子量为6.085 kD,等电点为7.73。该蛋白中半胱氨酸含量最高(30.5%),其次是赖氨酸(16.95%)和丝氨酸(10.17%)。相似性分析显示mn-MT氨基酸序列与美洲海螯虾、斑节对虾和中华绒螯蟹MT的相似性分别达到78%、75%和75%。(2)qRT-PCR分析显示, mn-MT mRNA在肝胰腺、血细胞、鳃、胃、卵巢、肠和肌肉中都有表达,其中肝胰腺中表达量最高。(3)用4组铜添加量分别为0、20、40及160 mg/kg的饲料和3组锌添加水平分别为0、35和210 mg/kg的饲料饲喂初重为(0.1010.002) g日本沼虾56d后,分析各组虾肝胰腺的mn-MT mRNA表达。mn-MT mRNA表达随饲料铜水平的提高而升高,到40 mg/kg组达到最高(P0.05),而后开始下降;饲料中高锌(210 mg/kg)显著提高mn-MT表达(P0.05), 0和35 mg/kg组间差异不显著(P0.05)。结果表明饲料中铜/锌均可影响mn-MT表达,且呈现不同的剂量依赖效应。       

紫茉莉4,5-多巴双加氧酶基因的克隆和表达

通过同源克隆的方法分离了紫茉莉的4,5-多巴双加氧酶(4,5-Dopa-dioxygenase)基因的cDNA片段,并对该基因能在紫茉莉花发育的5个时期的表达作分析。结果表明,该基因的cDNA片段长度801bp,与甜菜和太阳花的同源性分别为67%和63%。该基因均可在转录水平表达,但在紫茉莉不同发育时期的表达量有一定差异,随着发育时期的推进其表达量逐渐增强。     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA(命名为HbC2)。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5'-UTR和232bp的3'-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。