新生隐球菌SER5基因的敲除与功能验证研究

目的构建新生隐球菌SER5基因缺陷株,并初步探究其功能。方法敲除SER5基因,通过体外应激应答、黑色素诱导、荚膜诱导、尿素酶测定、生长曲线测定、酵母双杂交实验考察SER5在新生隐球菌中的功能。结果成功构建SER5基因缺陷株,SER5基因缺失后对新生隐球菌的体外应激、荚膜、分解尿素及生长没有显著的影响,但新生隐球菌黑色素合成有显著的降低,通过酵母双杂交实验筛选出可能与Ser5相互作用的19种不同的蛋白编码基因。结论新生隐球菌Ser5影响新生隐球菌黑色素生成,可能与内质网蛋白、内质网稳定蛋白、VAMP7、磷脂转运蛋白、Gmt1、Vti1a等存在相关作用,提示Ser5参与新生隐球菌黑色素的合成或转运过程。     

新生隐球菌MIS1基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向新生隐球菌MIS1基因的siRNA重组表达载体质粒,并进行鉴定.方法 根据GenBank的MIS1基因序列,按照载体要求设计单链引物,克隆到空载体psilencer4.I-CMV neo中,经过LiAc化学法将重组质粒转染到新生隐球菌细胞中并用G418筛选,利用real time PCR鉴定阳性细胞的MIS1基因水平.结果 重组表达质粒Psilencer4,1-CMV-si-MIS1经PCR、双酶切及测序鉴定,结果证明重组表达载体构建成功,其能在mRNA水平显著抑制MIS1的表达.结论 已成功构建新生隐球菌MIS1基因的siRNA表达载体,为深入研究MIsl在隐球菌相关疾病的发生及发展中的作用提供了技术手段.     

新生隐球菌共孵育后小鼠脑血管内皮细胞S100A10基因的表达水平变化

目的探讨S100A10基因在新生隐球菌感染脑血管内皮细胞中的作用。方法将新生隐球菌H99株与小鼠脑血管内皮细胞共孵育后,不同时间终止共孵育,提取小鼠脑血管内皮细胞的总RNA,采用实时定量荧光PCR检测S100A10的表达水平。结果在与新生隐球菌共孵育2h后,小鼠脑血管内皮细胞中的S100A10基因表达水平随着共孵育时间的延长而升高（P〈0.05）。结论S100A10基因在新生隐球菌对中枢神经系统的易感性存在一定的作用。     

新生隐球菌漆酶的原核表达

目的构建含His-tag的新生隐球菌漆酶的原核表达载体并表达鉴定。方法利用PCR技术扩增LAC1基因的编码序列,将其正确插入pET-28a(+)载体中得到重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后进行PCR鉴定及基因测序。将正确重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过不同条件进行诱导表达,用SDS-PAGE电泳及MALDITOF质谱检测并鉴定目的蛋白质。通过尿素对包涵体蛋白进行变性,并对变性后的蛋白进行SDS-PAGE电泳及MALDITOF质谱检测。结果成功构建含His-tag的新生隐球菌漆酶的原核表达载体,PCR鉴定呈阳性且基因测序结果与目的序列一致,SDS-PAGE显示在大肠杆菌BL21中成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约为68 000的目的蛋白,经MALDITOF质谱鉴定目的蛋白在此表达系统中不可溶,可能以包涵体形式存在。结论成功构建含His-tag的新生隐球菌漆酶的原核表达载体,为进一步纯化并解析新生隐球菌漆酶的晶体结构奠定了基础。     

新生隐球菌STE12α基因的克隆及表达载体的构建

目的从新生隐球菌的基因组中扩增出STE12α基因,并构建相应的表达载体,以进一步研究STE12α基因对隐球菌的生长特性及致病性的影响。方法采用PCR方法以及基因重组方法扩增并克隆新生隐球菌基因组中的STE12α基因,建立具有表达野生型STE12α基因的表达载体。结果从新生隐球菌的基因组获得STE12α全基因,建立重组子pUCm—STE12α／NovaBlue以及重组表达载体质粒pGAPZ—STE12α,实现了STE12α基因的转化并获得表达。结论成功地克隆了新生隐球菌STE12α基因并构建了可表达野生型STE12α基因的表达载体,为进一步研究STE12α基因功能打下了良好的基础。     

新生隐球菌荚膜研究现状

新生隐球菌是一种专性需氧条件致病菌,它的细胞壁外包绕着一个多糖荚膜,是其主要毒性因子之一。荚膜主要包含两种多糖-葡萄糖醛酸木糖和半乳糖甘露聚糖,此外还有少部分的甘露糖蛋白。这些多糖分子除构成多糖荚膜外,同时也参与新生隐球菌与宿主之间的免疫反应。该文对新生隐球菌荚膜的结构、生物合成、免疫反应及针对荚膜的抗真菌治疗等方面作一综述,旨在为新生隐球菌相关疾病的研究提供新的思路。     

变形链球菌致龋抗原基因在乳酸乳球菌的表达

目的 克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中表达.方法 在实验中利用了分子克隆技术构建携带GbpB基因的重组原核表达质粒pNI1,将重组质粒转化乳酸乳球菌YF02株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的GbpB蛋白用SDS-PAGE进行鉴定.结果 成功克隆了GbpB功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中得到其融合蛋白的表达.结论 利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得乳酸乳球菌融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.     

STE12α基因对新生隐球菌形态学影响的初步研究

目的研究STE12α基因对新生隐球菌形态学的影响。方法分别敲除血清A型和血清B型新生隐球菌菌株的STE12α基因,建立缺陷株,再将STE12α基因重新导入建立重建株。观察并比较野生株、STE12α基因缺陷株及重建株在体内、外孵育后菌落和菌落的形态学差异。结果 STE12α基因缺陷株组形成的菌落明显偏少,菌株直径偏小,荚膜发育不良,而重构株组这些方面的改变都得到了恢复。结论 STE12α基因对新生隐球菌的形态学改变有着重要的影响,可能直接影响其毒力。     

格特隐球菌HOG1基因的敲除及重建

目的 构建格特隐球菌HOG1基因缺陷株和HOG1基因重建株.方法 从格特隐球菌基因组扩增HOG1基因,通过部分基因缺失方法,获得缺陷基因dHOG1.将获得的HOG1基因及其缺陷基因dHOG1分别亚克隆到真核表达载体pGAPzα-A,构建pGAPzα-HOG1及pGAPzcα-dHOG1质粒.将pGAPzα-dHOG1质粒转染隐球菌原始株,通过筛选获得HOG1基因缺陷菌株;同样方法将pGAPzα-HOG1质粒转染格特隐球菌HOGI基因敲除菌株,获得HOGI基因重建株.结果 RTPCR结果示:格特隐球菌HOG1基因缺陷株不转录表达完整的HOG1基因,而HOG1基因重建株可以转录表达完整的HOG1基因片段.结论 成功获得格特隐球菌HOG1缺陷株和HOG1基因重建株,为后续格特隐球菌毒力和致病机制的研究奠定了基础.     

条件启动子pCTR4在隐球菌基因表达调控中的应用

目的通过条件启动子pCTR4的质粒构建以及其在新生隐球菌中的同源置换,研究其在隐球菌基因表达调控中的应用。方法应用套叠PCR,构建含报告基因NEO的铜离子抑制性启动子质粒pNEO/CTR4和启动子同源重组框,并利用基因枪将其转化入新生隐球菌感受态细胞,常规及实时定量PCR检测条件启动子对目的基因的转录调控效应。结果成功构建了质粒pNEO/CTR和隐球菌条件启动子重建菌株,条件启动子pCTR4对目的基因具有预期的转录诱导和抑制效果。结论新建铜离子抑制性启动子质粒pNEO/CTR4可以应用于对隐球菌目的基因表达水平的调控;隐球菌泛素编码基因UBI 1并非致死性关键基因。我们的研究为今后新生隐球菌泛素系统的分子致病机制研究奠定了基础。     

巨噬细胞对新生隐球菌主要毒性基因表达的影响

目的研究巨噬细胞对新生隐球菌B3501标准株的主要毒性基因表达影响。方法将对数生长期的J774．16巨噬细胞分别与新生隐球菌野生株B3501共孵育4h,收集被J774．16吞噬的B3501作为实验组,提取实验组和在37℃条件下5％二氧化碳单独培养的对照组B3501的RNA,采用实时荧光定量PCR技术,检测J774．16细胞内和对照组B3501的CNLAC1、CAP60、URE1、NMT表达的差异。结果实验组中新生隐球菌的CAP6,CNLAC1,NMT及URE1基因的mRNA在每百万看家基因（GAPDH基因）中的平均含量分别为（2．698±0．084）×10^4,（1．806±0．322）×10^4,（2．267±0．074）×10^4和（4．041±0．271）×10^4;而对照组这4种毒性因子基因含量分别为：（1．139±0．183）×10^6,（9．324±5．028）×10^3,（1．326±0．028）×10^6和（1．307±0．001）×10^6,均远比实验组高,其中以NMT最为明显。结论新生隐球菌被巨噬细胞吞噬后,主要的毒性因子基因表达下降,其中以NMT最为明显,而CNLAC1下降幅度最小。     

抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10单克隆抗体的制备及鉴定

目的:以新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10为靶抗原,制备并鉴定特异性抗CAP10的单克隆抗体。方法:用纯化的重组CAP10免疫BALB/c小鼠,血清抗体效价达到适当水平时进行细胞融合;经多次亚克隆筛选出分泌特异性抗体的细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定。结果:获得11株能稳定分泌抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10的单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗体效价高且抗原特异性强。结论:获得了针对新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10的单克隆抗体,为深入研究CAP10蛋白的功能,以及临床新型隐球菌的检测和血清型分析奠定了基础。     

Enhancement of organophosphorus hydrolase yield in Escherichia coli using multiple gene fusions

It was previously shown that organophosphorus hydrolase (OPH) expression and purification could be tracked by fluorescence of green fluorescent protein (GFP) when synthesized as an N-terminal fusion with GFP (Cha et al., 2000; Wu et al., 2000). In order to enhance OPH productivity while utilizing the advantage of the reporter protein (GFP), two copies of OPH were cloned in tandem following the gfp(uv) gene (e.g., GFP-OPH(n=2)). Both anti-GFP and anti-OPH Western blots demonstrated that a higher yield was achieved in comparison to the one copy fusion (GFP-OPH). Importantly, the fusion protein was still fluorescent as determined via microscopy. In contrast, a fusion containing two copies of OPH without GFP, and an operon fusion of two OPHs with two independent ribosomal binding sites, did not result in a higher yield than one OPH expressed alone.     

信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA 蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响

[目的]构建绿色荧光蛋白(GFP)与禽流感病毒(AIV)HA基因的融合表达载体,观察信号肽序列的有无及位置对HA-GFP在293T细胞中的表达影响.[方法]应用PCR方法从H5N1亚型AIV质粒DNA中扩增出完整的或除去信号肽序列的HA基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和SmaⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的不同位点,将得到的重组体M1,M2和M3分别转化宿主菌DH5a,经双酶切及.DNA测序鉴定分析后,采用脂质体转染法将pEGFF-C1,M1,M2和M3转染人胚肾细胞系293T细胞,荧光显微镜下观察HA-GFP的表达,流式细胞仪检测表达HA蛋白的细胞百分数.[结果]经酶切及测序鉴定成功构建了HA-GFP重组表达载体M1,M2和M3,荧光显微镜及流式细胞仪检测到重组质粒转染的293T细胞表达强的荧光蛋白,信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达有显著影响,信号肽序列使HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达减少,而信号肽的位置对融合蛋白表达量的影响不显著.[结论]信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在细胞中的表达有显著影响.     

新生隐球菌GXM的纯化及其对巨噬细胞甘露糖受体表达调节的研究

目的从新生隐球菌B3501培养上清中分离和纯化荚膜多糖葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM),观察其是否能调节巨噬细胞甘露糖受体MR的表达。方法采用乙醇沉淀荚膜多糖,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)特异性沉淀方法获得GXM,将GXM与巨噬细胞共孵育24 h,Western blot检测MR的表达变化情况。结果获得了毫克级的GXM,巨噬细胞与GXM孵育后甘露糖受体(mannose receptor,MR)的表达没有明显变化。结论新生隐球菌荚膜多糖GXM不影响巨噬细胞甘露糖受体MR的表达。     

Microreview: Capsule-associated genes of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis, caused by Cryptococcus neoformans is a common systemic mycosis in man and animals, particularly immunocompromised patients. This pathogenic fungus produces a thick extracellular polysaccharide capsule. Four capsule-associated genes (CAP10, CAP59, CAP60, CAP64) were cloned and sequenced, and proved to be essential for capsule synthesis. However biochemical functions of CAP gene products have not been clarified yet. Recently, the relatedness of the polysaccharide capsule and four capsule-associated genes has partly been elucidated. Nucleotide sequence of four CAP gene fragments was analyzed for phylogenetic relationships, and they were in agreement with the conventional classification of varieties and serotypes within C. neoformans. Expression of four CAP genes and capsule size were examined using two media containing different amount of glucose, and the results indicated that CAP genes might play important roles in elaboration of extracellular polysaccharide capsule. Furthermore, analyses of CAP genes in various clinical samples would give the useful information to diagnose cryptococcosis in human and animals.     

Diversity among strains of Cryptococcus neoformans var. gattii as revealed by a sequence analysis of multiple genes and a chemotype analysis of capsular polysaccharide.

We demonstrated the diversity of Cryptococcus neoformans var. gattii strains by a sequence analysis of multiple genes: (i) the intergenic spacer (IGS) 1 and 2 regions of the rRNA gene; (ii) the internal transcribed spacer (ITS) region, including 5.8S of the rRNA gene; (iii) TOP1 (topoisomerase); and (iv) CAP59. In these studies, we compared C. neoformans var. gattii with varieties grubii, and neoformans of C. neoformans. Phylogenetic analysis indicated that both C. neoformans var. grubii and C neoformans var. neoformans are monophyletic, but C. neoformans var. gattii showed polyphyletic. C. neoformans var. gattii can be divided into three phylogenetic groups, I, II, and III, with high bootstrap support. Phylogenetic group I contains serotype B and C strains, and groups II and III include serotype B strains. Because the serotype B strains of C. neoformans var. gattii exhibited more genetic divergence, the serological characteristics and chemotypes of their capsular polysaccharide were further investigated. No remarkable difference among the serotype B strains was found in the reactivities to factor serum 5, which is specific for serotype B. The NMR spectra of the capsular polysaccharide from serotype B strains could be divided into three characteristic patterns, but the chemical shifts were very similar. These results suggested that the serotype B strain of C. neoformans var. gattii has more genetic diversity than the serotype C strain of C. neoformans var. gattii or the varieties grubii and neoformans of C. neoformans, but there was no correlation between genotype and chemotype.