cry3A和vhb基因在转基因马铃薯中的表达

分别构建了含cry3A和cry3A+vhb基因的植物表达载体pBCry3A和pBC₃Vhb,并通过根癌农杆菌介导转化了马铃薯. 对转化再生植株进行PCR和DNA印迹分析表明,外源基因已整合到马铃薯基因组中, 且连续三代无性繁殖后转基因仍存在. ELISA分析表明cry3A基因在转基因植株中得到了高效表达, 在单转cry3A植株中最高表达量达0.1%, 转cry3A与vhb双基因株系中为0.065%. 水涝试验显示,转双基因且vhb mRNA的RT-PCR呈阳性的马铃薯植株,对低氧胁迫有较好的耐受性, 表明获得的上述转双基因马铃薯株系可能会具有很好的抗虫和耐涝性能.     

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响

【目的】为探究转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响。【方法】以转Cry1Ac/1Ab基因棉与其亲本常规棉为实验材料,利用取食不同棉花品种叶片的棉铃虫饲喂异色瓢虫幼虫。【结果】与常规亲本棉相比,取食饲喂转基因棉花叶片的初孵棉铃虫幼虫的异色瓢虫幼虫从1龄发育至化蛹期时间延长0.77 d,但差异不显著;除1龄幼虫体重增加(0.0773 mg)外,其余各龄期幼虫体重均有所下降,但差异均不显著;异色瓢虫1、2、3、4龄幼虫对初孵棉铃虫捕食量均随棉铃虫密度的增加而增加,捕食功能反应均符合HollingⅡ圆盘方程。【结论】转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育无显著影响,饲喂取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花的棉铃虫对异色瓢虫捕食功能无显著差异。     

棉花EIN3/EIL家族基因序列分析及GhEIL3基因克隆

该研究以拟南芥AtEIN3基因为探针,从陆地棉TM-1全基因组测序数据库中筛选其同源序列,序列分析得到16条具有EIN3结构域的基因序列。对陆地棉EIN3/EIL家族基因的基因结构、系统进化、序列相似性及结构域分布情况进行分析,发现它们与拟南芥EIN3/EIL家族基因在N端具有较高相似度,其中15条基因序列包含5个保守结构,1条包含4个保守结构。在此基础上,采用RT-PCR方法从抗枯萎病的陆地棉品种‘中棉所12’中克隆得到一个新的EIN3/EIL家族基因,命名为GhEIL3(GenBank登录号为KY072936)。序列分析表明:GhEIL3基因开放阅读框长1 092bp,编码363个氨基酸,含有一个EIN3结构域。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,GhEIL3基因在枯萎病菌诱导后呈上调表达,诱导后1h其相对表达量达到最大值,推测GhEIL3基因可能参与棉花对枯萎病菌的防御反应。     

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花主要生化物质含量变化及其对棉田昆虫的影响

【目的】新型转基因棉花在进入大规模商业化应用前,需对其生态环境安全性进行评价;同时,经基因改造的新型转基因抗虫棉花可能影响抗虫棉的次生代谢,进而导致一些综合的生态学效应,致使棉花生理上发生改变,这也是转基因植物安全性评价研究的重要内容。【方法】比较了不同关键时期新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花与转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比、主要酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)]活性、营养物质(蛋白质、氨态氮、脯氨酸和可溶性糖)和次生代谢产物(棉酚和单宁)含量的差异及其对棉田不同昆虫营养层昆虫个体总数和物种数的影响。【结果】棉花生长的蕾期、花期和花铃期,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比呈先升高后降低的趋势;SOD和POD活性在花铃期明显升高,CAT、APX和GR活性无显著变化;蛋白质、氨态氮含量无明显变化,脯氨酸和可溶性糖含量均表现为先升高后下降的趋势;棉酚含量在3个时期无显著变化,而单宁含量呈逐渐升高的趋势。3种棉花叶片中干物质积累、主要酶活性、营养物质和次生代谢产物含量均无显著差异;单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花转Cry1Ac基因棉花非转基因棉花,小铃数则表现为转Cry1Ac基因棉花Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花非转基因棉花;昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数均表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田转Cry1Ac基因棉田非转基因棉田,天敌亚群落昆虫个体总数无显著变化;3种棉田中昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的物种数均未发生显著变化。【结论】转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花叶片干物质积累、产量性状、生化物质含量、酶活性在不同生长期表现不同,但上述参数在3种棉花之间无显著差异;且转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花具有较好的抗虫性,能有效降低棉田害虫数量。     

转双价抗虫基因大白菜新种质的获得及其抗虫性分析

采用超声波辅助花粉介导方法,将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase导入早熟型大白菜自交系20-19-3,最终获得了5个转基因大白菜优良自交系纯合株系Z1-5、Z2-7、Z9-6、Z11-6和Z20-13;以转基因大白菜株系和非转基因对照植株为材料,对BmkIT-Chitinase基因在大白菜中的遗传规律、基因表达及抗虫性进行进一步分析。结果显示:(1)转化株后代多代(T_1~T_4)PCR、Southern blotting等分子跟踪检测表明,目的基因已成功导入受体植株,且能够稳定遗传;用该转基因方法对大白菜进行基因转化所获得的转基因植株分析显示,外源基因多数以多拷贝形式整合于核基因组,少部分外源基因以单拷贝形式整合。(2)Elisa分析结果证明,所导入的外源基因可高效表达,T4代株系新鲜叶片中表达产物量最高达到0.069μg·g~(-1)左右。(3)转基因株系田间抗虫性统计分析表明,转化株系与对照在抗虫性方面有显著差异,其对小菜蛾及菜青虫抗性普遍提高2~3级。研究认为,转BmkIT-Chitinase基因大白菜中BmkIT-Chitinase基因的表达可有效提高大白菜的抗虫性。     

棉花GhVHA A基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析

为进一步验证棉花GhVHA-A基因的功能,该研究将棉花GhVHA-A基因构建到原核表达载体pET28a上,利用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,同时对重组大肠杆菌BL21(pET28a-GhVHA-A)进行抗逆性分析。结果表明:(1)半定量RT-PCR分析发现,棉花幼苗液泡膜H+-ATPase基因(GhVHA-A)表达水平受脱水和高盐胁迫诱导。(2)将1 872bp长的编码区序列连接至原核表达载体pET28a上,成功构建了原核表达载体pET28a-GhVHA-A;SDS-PAGE电泳检测结果表明,在70kD左右处有1条特异表达的蛋白质条带,与预期的目的产物大小一致。(3)重组菌BL21(pET28a-GhVHA-A)的抗逆性分析发现,重组菌对PEG6000(20%)和NaCl(0.5mol/L)的抗性明显高于对照菌株BL21(pET28a),表明GhVHA-A基因在大肠杆菌中表达后能够增强菌株的抗性。本研究结果为GhVHA-A基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了理论依据。     

地黄C3H基因的克隆及生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶属于植物中最大的蛋白酶细胞色素P450家族之一,在植物生命活动中发挥着重要作用。为了解地黄香豆酸-3-羟化酶基因RgC3H合成毛蕊花糖苷的功能,该研究基于地黄代谢组学分析获得KEGG途径中的C3H,采用多重比对在NCBI中获得同源基因的一个保守序列,并基于该保守序列和地黄SRA数据库,采用电子克隆和RT-PCR克隆技术获得地黄C3H基因全长CDS(RgC3H),对其进行生物信息学分析。结果表明:RgC3H基因全长为1 530 bp,且编码一个含509个氨基酸、分子量为57.91 kD、无信号肽的蛋白质; 基于氨基酸序列的结构分析显示,RgC3H有一个保守区域-P450结构域; 系统进化分析结果显示,RgC3H与芝麻和猴面花的C3H基因具有很高的同源性。上述结果为进一步研究RgC3H基因在地黄毛蕊花糖苷生物合成途径中的作用奠定了基础。     

转Cry1Ac基因抗虫玉米Bt-799对田间节肢动物群落多样性的影响

【目的】安全评价是转基因品种研发的重要保障,为明确转基因玉米Bt-799在生物多样性影响方面的安全性,并为其在吉林春玉米区种植提供安全保证,开展了转基因玉米Bt-799对田间节肢动物群落多样性影响的研究。【方法】综合利用直接观察法和地面陷阱法,以多样性指数、均匀度指数、优势度指数等参数以及主要种群动态作为评价指标,系统研究转基因玉米Bt-799对田间节肢动物群落多样性的影响。【结果】转基因玉米Bt-799较之对应的非转基因对照郑58在田间节肢动物群落结构参数、主要种群动态等方面均无显著差异。【结论】转Cry1Ac基因玉米Bt-799在吉林省种植,不会对田间节肢动物群落多样性造成显著不良影响。     

盐碱旱地转Bt基因抗虫棉田主要害虫及其天敌种群消长动态

【目的】近年来,我国长江流域和黄河流域棉花面积锐减,种植区域向滨海盐碱地或干旱地转移。研究盐碱旱地转基因棉田与非转基因棉田昆虫群落差异,可为盐碱旱地对转基因棉田生物影响和盐碱旱地转基因棉田害虫防治提供理论指导。【方法】在山东东营和河北枣强盐碱干旱地转Bt基因棉田分别设置常规施药田和非施药田,进行了系统的田间昆虫种群消长动态的调查和统计分析。【结果】中轻度盐碱旱地种植转基因棉花对靶标害虫棉铃虫具有较好的控制作用;与非转基因棉花相比,对其他非靶标害虫棉蚜、烟粉虱和盲蝽及自然天敌龟纹瓢虫、草间小黑蛛种群数量无显著影响,草蛉种群数量在转基因棉田低于非转基因棉田;喷施化学农药对棉铃虫幼虫和棉蚜的防治作用较好,对烟粉虱和盲蝽的防治效果年度间和试验点间有差异,对龟纹瓢虫的杀伤力较大,对草间小黑蛛和草蛉未见明显影响。【结论】盐碱旱地对棉田不同的害虫和天敌影响不同,且转基因棉田与非转基因棉田昆虫群落结构与对照棉田无显著差异。     

转新型双抗虫基因棉花的遗传分析

首次用含合成的BtCrylAc活性杀虫蛋白嵌合基因及慈菇蛋白酶抑制剂B(API-B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体,通过土壤根癌杆菌介导转化棉花品种冀合321,获得一批抗虫的转化再生棉花植株。利用叶片涂抹卡那霉素、叶片离体养虫和PCR扩增等检测方法对6个不同转双抗虫基因株系的抗虫性进行遗传分析。结果显示,转化株系自交的T1抗虫性状遗传较为复杂;农杆菌介导获得的转基因抗虫棉在早期世代不易选到纯合系,但是随着对抗虫性状进行单向选择,到T4和T5就能获得抗虫纯合系。利用抗虫性稳定的转化后代材料和转化受体进行田间杂交,发现F2抗虫性分离完全符合一对或两对显性基因的分离规律,并证明了DR248和DR193两个材料为外源基因双拷贝插入。转化株系的Southern杂交也证明了上述结果。     

不同性状的棉花及其杂交F1代对棉铃虫的抗性

通过连续两年的田间试验,系统、全面地研究了棉花对棉铃虫(Helicoverpa armigera)的形态抗虫作用。研究结果表明：在小区试验条件下,以百株累积卵量、百株平均幼虫量及百株平均蕾铃受害量为考察指标,红叶可使危害减轻28.1%、31.45%和36.O%;鸡脚叶可使其下降19.0%、25.4%和28.4%;窄卷苞叶使其降低25.8%、32.9%和34.0%;光叶使各指标分别降低32.7%、35.1%和37.3%。高棉酚(油腺)抗性主要表现为对幼虫的抗生作用,使幼虫量下降了45.1%,使蕾铃受害量下降了51.4%。此外,研究还表明,两种抗虫性状的抗性效果有累加作用,鸡脚叶与红叶联合作用使三项指标分别下降达48.3%、55.2%和57.9%;红叶与窄卷苞叶则使危害减轻了52.7%、58.3%和60.6%;具有光叶与较密油腺两个抗虫性状的品种受害可减轻29.9%、54.9%和58.3%。将一些具有相对性状的品种进行杂交,其F₁有不同的抗虫表现。红叶、鸡脚叶和光叶品种与其对照杂交后的F1代因在不同程度上保持了抗虫性状故能表现出抗性,而窄卷苞叶品种与其对照杂交后F1代苞叶正常,则未能表现出抗性。因小区条件限制了无蜜腺抗性的表达,无蜜腺小区未表现出明显差异。     

转基因抗虫抗除草剂棉花对棉铃虫抗性及对草甘膦耐受性研究

本论文研究了抗虫又抗除草剂棉花对草甘膦的耐受程度,比较了这一双抗性状的棉花与单抗虫棉的抗虫效果。结果表明,抗虫又抗除草剂棉花对草甘膦有较好的耐受性,四叶期喷施草甘膦后抗虫抗除草剂棉花可以安全生长,蕾期喷施草甘膦对棉花的开花率和结铃率有影响。抗虫又抗除草剂棉花和单抗虫棉对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)均具有较好的防治效果,苗期棉花叶片对棉铃虫防治效果最好,后期防治效果下降到49.2%和46.6%,吐絮期防治效果又上升到57.0%和53.1%。     

Mechanisms of monocrotophos resistance in cotton bollworm,Helicoverpa armigera (Hübner)

Insensitive acetylcholinesterase was identified as a resistance mechanism by comparing biochemical analysis with a laboratory selected monocrotophos resistant cotton bollworm (RR: 200) and the susceptible strain. The cDNA encoding AChE was cloned by the method of RACE (rapid amplification of cDNA ends). The complete AChE gene deduced from the cDNA consisted of a putative signal peptide of 32 amino acid residues, a mature protein of 615 residues, 5' untranslated regions (UTR) of 315 bp and 3' UTR of 324 bp. The coding sequence had a high degree of homology to the AChE from other insect species reported in the GenBank. After comparing analysis of the entire AChE gene sequence from 5 resistant and 6 susceptible cotton bollworm individuals, nine mutations were identified. One of them, the Ala/Thr mutation, is likely to be responsible for the AChE insensitivity to monocrotophos.     

新vip3Aa基因的克隆、表达及其序列分析

克隆了Bt9816C的vip3A基因,并将测序结果提交到GenBank (序列号：AY945939)。该基因是一个新的vip3Aa基因, Bt杀虫晶体蛋白命名委员会将其命名为vip3Aa18。在大肠杆菌BL21中表达了该基因,生物测定结果表明纯化的Vip3Aa18蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性。序列分析结果显示Vip3Aa18 C端536至667位氨基酸残基间是一个糖类结合域,推测可能参与Vip3Aa18与敏感昆虫中肠受体结合;N端272至292位氨基酸残基间存在一个跨膜螺旋,可能与Vip3Aa18形成穿孔有关。此外,Vip3Aa18还可能具有一个二硫键。这些特殊区域和位点可能与其功能密切相关。     

棉花单宁-黄酮类化合物对棉铃虫的抗性潜力

陆地棉棉叶甲醇提取物包含了棉花的大部分单宁-黄酮类化合物。这些化合物对棉花多种病虫害具有抗性作用。将这些化合物定量加入人工饲料中饲养棉铃虫龄幼虫5d,结果表明,培儿茶素、缩合单宁、芸香苷和异槲皮苷在饲料中的浓度增加均与幼虫体重生长呈显著负相关,ED50分别为0．81％,0．49％,0．57％和0．83％;儿茶素则不存在这种关系;用含0．8％的浓度桔儿茶素、缩合单宁,芸香苷和异槲皮苷的饲料测试棉铃虫,发现随取食量的增加,相对生长率的增加显著低于对照(不含次牛物质),即这些物质属于慢毒剂,而儿茶素仅有阻食作用。     

The expression of a mammalian proteinase inhibitor,bovine spleen trypsin inhibitor in tobacco and its effects on Helicoverpa armigera larvae

The cDNA for bovine spleen trypsin inhibitor (SI), a homologue of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI), including the natural mammalian presequence was expressed in tobacco using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Stable expression required the N-terminal targeting signal presequence although subcellular localization was not proven. SI was found to exist as two forms, one coinciding with authentic BPTI on western blots and the second marginally larger due to retention of the C-terminal peptide. Both were retained on a trypsin-agarose affinity gel and had inhibitory activity. Newly emergent leaves contained predominantly the large form whereas senescent leaves had little except the fully processed form present. Intermediate-aged leaves showed a gradual change indicating that a slow processing of the inhibitor peptide was occurring. The stability of SI was shown by the presence of protein at high levels in completely senescent leaves. Modifications to the cDNA (3 and 5 changes and minor codon changes) resulted in a 20-fold variation in expression. Expression of modified SI in transgenic tobacco leaves at 0.5% total soluble protein reduced both survival and growth of Helicoverpa armigera larvae feeding on leaves from the late first instar. In larvae surviving for 8 days, midgut trypsin activity was reduced in SI-tobacco fed larvae, while chymotrypsin activity was increased. Activities of leucine aminopeptidase and elastase-like chymotrypsin remained unaltered. The use of SI as an insect resistance factor is discussed.     

棉铃虫迁飞规律及其与寄主植物的互作关系研究进展概况

用飞行磨、透射电镜、风洞等测定了棉铃虫Helicoverpa armigera(Htibner)成虫的飞行能力和飞行肌结构的变化,结合不同虫源滞育条件及抗寒能力比较、蛹与成虫的形态学比较及分子生物学标记、幼虫抗药性地理分布、海轮上捕捉、成虫携带花粉的分析和小规模成虫颜色标记-释放-回收试验,证明棉铃虫是一种典型的兼性迁飞性害虫;初步推断辽河流域特早熟棉区的棉铃虫虫源来自黄河流域棉区,各相邻的棉区之间有频繁的棉铃虫种群交流。观察棉铃虫触角上不同类型嗅觉感器的形态和分布,用EAG、GC-EAG、GC-MS等测试分析了棉铃虫对不同植物各器官抽提物的电生理反应及抽提物中的活性组分。发现吸引棉铃虫取食的挥发性它感化合物主要为极性较小的单萜烯类,而吸引其产卵的主要为倍半萜烯类及其它一些极性较大的化合物。改进了测定棉株内抗生性次生代谢产物的定性、定量方法,研究了棉酚、单宁对棉铃虫发育、繁殖的影响及2类次生物间的交互作用,通过杂交初步探讨了棉花常规抗虫性的遗传特性,并尝试了切断胚轴和转Bt基因内生菌处理棉花增强抗虫性的作用。认为在利用棉花自然抗虫性的同时,应结合各种人为手段增强其抗性,使其在棉铃虫猖獗条件下发挥更大的控制作用。从气候、营养、天敌、抗药性等方面研究了棉铃虫猖獗原因,初步认为：气候干旱是棉铃虫暴发的最主要环境条件,施肥水平特别是施氮量的日益增高是棉铃虫严重性上升的主要物质基础,而不合理使用化学农药是造成棉铃虫种群失控的主要人为因子。