血管紧张素Ⅱ受体阻断对心肌成纤维细胞信号转导相关基因表达谱的影响

为了研究血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）受体在成年大鼠心肌成纤维细胞的信号转导机制,分离及培养成年Sprague-Dawley大鼠心肌成纤维细胞,采用免疫组化染色测定AngⅡ受体的蛋白表达。将细胞随机分为四组进行药物干预48h：AngⅡ组、AngⅡ＋losartan组、AngⅡ＋PD123319组和AngⅡ＋losartan＋PD123319组。抽提mRNA制备cDNA探针,与G蛋白耦联受体信号通路发现者基因芯片杂交,筛选表达差异的基因。发现血管紧张素Ⅱ 1型（angiotensinⅡ type1,AT1）受体被losartan阻断后,AngⅡ刺激的心肌成纤维细胞血管紧张素Ⅱ2型（angiotensinⅡ type2,AT2）受体蛋白高表达;34个基因表达差异在2倍以上,30个下调,4个上调,其最大改变不超过20倍;9条信号通路被活化：cAMP／PKA、Ca^2＋、PKC、PLC、MAPK、PI-3K、NO-cGMP、Rho、NF-κB通路。当AT2受体被PD123319阻断时,64个基因表达差异在2倍以上,48个下调,16个上调;11条途径基础活化,其中7个基因的改变在30倍以上：Cyp19a1（37倍）、I1lr2（42倍）、Cflar（53倍）、Bcl21（31倍）、Pik3cg（278倍）、Cdknla（90倍）、Agt（162倍）。在AT1受体阻断的基础上再阻断AT2受体,46个基因表达差异在2倍以上,36个下调,10个上调;11条信号途径全部活化。其结果与单独阻断AT2受体信号途径基本一致。RT-PCR选取IL-1β和TNF-α进行验证,结果与芯片各组间的变化趋势基本相符。结果表明,在成年大鼠心肌成纤维细胞,AT2受体阻断明显不同于AT1受体阻断,在信号转导通路相关基因表达谱上,两者有显著差异。     

益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型ATP6基因表达的影响

目的：研究益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型ATP6（ATP synthase F0 subunit 6）基因表达的作用机制。方法：本实验用新生2-3dWistar大鼠心肌细胞,建立CVB,病毒感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术（SSH）,克隆了受CVB,攻击的心肌细胞中被中药（益气活血中药复方）调控的基因。结果：ATP6基因,在中药组中高表达,而病毒组中表达减弱或抑制。结论：益气活血中药复方能影响受CVB,病毒攻击的宿主细胞ATP6基因的表达,有效保护心肌、阻断病程进度,从而实现治疗病毒性心肌炎的目的。     

鉴别差异表达基因的新方法──抑制消减杂交法(SSH)

抑制消减杂交法（SuppressicSubtractiveHybridization,SSH）是最近（1996）报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法［1,2］。该方法是以抑制PCR和消减杂交法为基础,在一轮反应中实现mRNA的均等化和消减步骤。本文对SSH法的原理、优缺点作了介绍,并与其它检测差异表达基因的方法,如mRNA差别显示法（DDRT－PCR）、代表性序列差异分析（RDA）比较,认为SSH方法具有高效快速、高敏感性和假阳性低等优点。同时,625个克隆中有很大一部分是转录物丰度很低的基因,40％的克隆可能为新的基因。因此,SSH可作为鉴别差异表达基因和克隆新基因的有效方法。     

益气活血中药复方对CVB3 大鼠心肌细胞感染模型ATP6 基因 表达的影响

目的:研究益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型ATP6(ATP synthase F0 subunit 6)基因表达的作用机制。方法:本实验用新生2-3dWistar大鼠心肌细胞,建立CVB3病毒感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术(SSH),克隆了受CVB3攻击的心肌细胞中被中药(益气活血中药复方)调控的基因。结果:ATP 6基因,在中药组中高表达,而病毒组中表达减弱或抑制。结论:益气活血中药复方能影响受CVB3病毒攻击的宿主细胞ATP6基因的表达,有效保护心肌、阻断病程进度,从而实现治疗病毒性心肌炎的目的。     

家蚕胚胎期重力相关基因的抑制消减杂交分析

目的：筛选家蚕胚胎期重力相关基因。方法：对模拟失重与正常重力条件下的家蚕胚胎cDNA进行抑制消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH），并对模拟失重过程中家蚕胚胎期表达发生变化的基因进行克隆、测序及同源性分析。结果：获得了34个与重力有关的序列标签。在模拟失重条件下有16个基因表达上调，其中15个为未知基因，1个为已知基因，其作用是维持mRNA的稳定性。在模拟失重条件下有18个基因表达下调，其中4个为未知基因，6个为蛋白合成相关基因，3个为基因组contig基因，5个为家蚕est库中功能未知基因。结论：模拟失重环境影响了家蚕胚胎发育期与mRNA稳定性和蛋白质合成相关基因的表达。     

离心机训练后+Gz耐力相关基因的分离与鉴定

为探讨离心机训练提高正向加速度 (forwardacceleration ,+Gz)耐力的分子机制 ,应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)和斑点杂交技术筛选离心机训练 12d后测试高耐力组 (耐受 + 16Gz)与未训练对照组大鼠全脑的差异表达基因 .将获得的序列表达标签 (expressedsequencetag ,EST)进行特异性鉴定后 ,获得 7个上调EST ,其中 5个为已知基因的部分序列 ,2个为新EST ,它们的表达量均在训练 6d组最高 ,表明离心机训练可明显影响大鼠全脑特定基因的表达水平 ,这些基因表达水平的变化很可能与离心机训练提高机体 +Gz耐力的分子机制有关     

高血压大鼠心脏和血管MAPK磷酸酶-1表达的改变及对平滑肌细胞增殖的影响

目的和方法：比较自发性高血压大鼠（SHR）和对照（WKY）大鼠心脏和主动脉丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶－1（MKP－1）及细胞外信号调节激酶（ERK－1）的表达,并观察用磷酸钙共沉淀方法转染MKP－1基因对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）刺激平滑肌细胞（VSMC）^3H－胸腺叫啶（^3H-TdR)掺入的影响,以探讨MKP－1在细胞增殖中的调节作用。结果：①与WKY大鼠相比,SHR心脏和主动脉MKP－1呈低表达,分别降低53％和45％（P均＜0．01）;而SHR心脏和主动脉ERK－1呈明显高表达（P均＜0．01）,SHR心脏和主动脉ERK－1与MKP－1蛋白比值明显高于WKY。②AngⅡ 10^-7mol/L刺激VSMC增殖较对照组增加257％（P＜0．01）,转染野生型MKP－1基因细胞可使AngⅡ刺激的^3H-TdR掺入较未转染的细胞降低63％（P＜0．05）,转染突变型MKP－1基因和转染空载体的VSMC对AngⅡ的刺激与单纯AngⅡ组相比无明显抑制作用（P＞0．05）。结论：SHR心血管组织中促增殖肥大的ERK－1表达较其失活的MKP－1占优势,并且MKP－1可显著抑制AngⅡ的VSMC增殖。     

筛选代表小鼠植入前胚胎紧密化相关基因的EST

分别收集181及241枚昆明白小鼠8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎,采用SMART PCR方法直接合成胚胎双链cDNA.进而运用抑制消减杂交技术(SSH)对8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎的基因表达进行研究,并将所获得的差异表达产物按片段大小分段分离纯化后克隆入pUCm-T载体中,经PCR鉴定后挑选阳性克隆进行测序,筛选出27个代表8细胞早期胚胎和紧密化8细胞胚胎差别表达基因的cDNA片段;经与GenBank中收录的序列进行同源性匹配分析,证实其中17个eDNA片段为新的EST,提交GenBank后被接受并给予了新序列编号.这1 7个片段均可能为与紧密化密切相关的新基因的表达片段,为今后进一步克隆新的紧密化相关基因的全长cDNA及后续新基因的结构和功能研究打下基础.通过采用不同长度大小片段分别克隆的方法,可获得较长片段的EST,避免差异表达大片段的丢失.     

DADS诱导HL-60 G2/M期阻滞消减文库的构建与初步筛选

目的:构建DADS诱导HL60-细胞G2/M期阻滞的差异表达文库,初步筛选相关基因.方法:分别提取无DADS和有DADS处理HL-60细胞的总RNA和mRNA,构建消减cDNA文库.随即挑选正向SSH的阳性克隆,PCR检测插入片段,将含插入片段的克隆测序.Blastn分析差异cDNA片段的同源性.结果:构建了DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达文库,其中包含120个正向SSH的克隆和100个反向SSH的克隆.50个随机正向SSH的克隆测序、比较同源性,发现5个新EST片段,已经在GenBank中登录.结论:所构建的DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞消减文库为进一步筛选白血病HL-60细胞G2/M期阻滞相关基因奠定了基础.     

沉默MR-1对血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌肥厚基因表达谱的影响

肌纤基因调节因子(myofibrillogenesis regulator1,MR1)是首次从人体骨骼肌cDNA文库中分离得到的基因.以前的研究证明MR1能够介导血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的体内外心肌肥厚效应,但相关分子机制有待进一步阐明.利用腺病毒载体在小鼠中沉默MR1表达,利用基因芯片对比检查了小鼠心肌基因表达谱的变化.结果发现,在AngⅡ诱导心肌肥厚的小鼠,沉默MR1前后出现明显的信号通路方面的变化和基因表达差异,其中沉默MR1后表达降低90%以上的基因有39个,而表达升高10倍以上的基因有5个.在这些基因中,对与心肌肥厚密切相关的基因进行了定量RT-PCR检测,以进一步验证基因芯片的结果,发现沉默MR1后HSP72和硫氧还蛋白1(Trx1)均表达升高,而钙调神经磷酸酶β(CnAβ)和β肌球蛋白(β-myosin)的基因表达则受抑制.这些信号通路和基因均与AngⅡ诱导的心肌肥厚有一定的关系,为揭示MR1在AngⅡ所致心肌肥厚中的作用和分子机制提供了新的证据.     

Identification of putative parasitism genes expressed in the esophageal gland cells of the soybean cyst nematode Heterodera glycines

Cloning parasitism genes encoding secretory proteins expressed in the esophageal gland cells is the key to understanding the molecular basis of nematode parasitism of plants. Suppression subtractive hybridization (SSH) with the microaspirated contents from Heterodera glycines esophageal gland cells and intestinal region was used to isolate genes expressed preferentially in the gland cells of parasitic stages. Twenty-three unique cDNA sequences from a SSH cDNA library were identified and hybridized to the genomic DNA of H. glycines in Southern blots. Full-length cDNAs of 21 clones were obtained by screening a gland-cell long-distance polymerase chain reaction cDNA library. Deduced proteins of 10 clones were preceded by a signal peptide for secretion, and PSORT II computer analysis predicted eight proteins as extracellular, one as nuclear, and one as plasmalemma localized. In situ hybridization showed that four of the predicted extracellular clones were expressed specifically in the dorsal gland cell, one in the subventral gland cells, and three in the intestine in H. glycines. The predicted nuclear clone and the plasmalemma-localized clone were expressed in the subventral gland cells and the dorsal gland cell, respectively. SSH is an efficient method for cloning putative parasitism genes encoding esophageal gland cell secretory proteins that may have a role in H. glycines parasitism of soybean.     

激活蛋白处理水稻引发基因差异表达的研究

利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)成功构建了植物激活蛋白处理水稻与非处理组水稻中差异表达的消减cDNA文库。从文库中一共筛选到1756个克隆,通过反向Northern杂交,从中得到264个有效克隆并测序,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对分析,获得28个上升表达差异基因。通过分析这些基因与植物的光合作用、营养物质的运输代谢等多种植物的生理生化功能相关。本研究为揭示激活蛋白的作用机理奠定基础。     

肝细胞癌高表达基因cDNA文库的构建及生物信息学分析

目的:构建肝细胞癌的高表达基因cDNA文库并进行相应的生物信息学分析。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术,以7对肝癌组织和癌旁组织为实验材料,构建肝癌高表达基因的cDNA文库;使用BioEdit、BLAST和EGAD等软件进行生物信息学分析。结果:获得1450个白色阳性克隆,经PCR扩增后均有100～1000bb的插入片段,经杂交验证选取125个克隆进行测序;经BLAST、EGAD等生物信息学工具分析获得基因83个,其中细胞分裂相关基因5个,参与细胞信号转导或通讯的基因5个,参与细胞结构或运动的基因7个,细胞或器官防御相关基因11个,参与细胞内基因转录或蛋白表达的基因22个,代谢相关基因18个,另有15个未归类基因。结论:利用SSH技术可构建肝细胞癌组织差异表达基因的消减cDNA文库,为进一步深入探讨肝癌的诊断、治疗和预后评估等提供更多的分子指标。     

用少量样本进行抑制性消减杂交

利用根据cap-finder方法建立的全长cDNA合成技术,扩增获得了恒河猴着床点子宫内膜组织表达mRNA的双链cDNA,通过抑制性消减杂交,成功地构建了恒河猴着床点消减文库.随机挑选文库中的阳性克隆,经点杂交证明27％为着床点差异表达的克隆.由此表明抑制性消减杂交结合cap-finder扩增全长cDNA的方法,可以有效地从少量而珍贵的样本中获得高质量的消减文库.     

奉节脐橙果皮褐变差减文库的构建及初步分析

以奉节脐橙果实为材料,采用抑制差减杂交技术,分别以褐变与未褐变柑橘果皮作为检测方和驱动方,成功构建了果皮褐变的差减cDNA文库,对部分克隆进行了序列测定并与GenBank进行了同源性比较。选择其中的4个基因:钙结合蛋白同源基因、半胱氨酸蛋白酶同源基因、NAC蛋白质家族同源基因和膨胀素同源基因进行半定量RT-PCR分析,结果表明它们在褐变果皮中的表达量均高于未褐变果皮,说明这些基因的增强表达可能与脐橙果皮褐变有密切关系。     

应用抑制性消减杂交技术克隆大鼠肝再生过程中特异表达基因

应用抑制性消减杂交技术成功地构建了高消减效率的正向消减cDNA文库,从随机挑取的50个克隆中有31个均检出了60~400bp插入片段,对这些插入cDNA片段进行测序后经Genbank同源性检索,表明其中7个片段为未知新序列。大鼠肝切除后肝再生cDNA正向消减文库的建立为进一步大批量筛选、克隆肝再生特异性表达的未知新基因奠定了基础,初步筛选出的特异性表达的序列标记为进一步研究肝再生中基因的功能提供了依据。 Abstract:The cDNA from rat regenerating liver tissue was used as the tester and that from normal liver was used as the driver.A highly efficient subtractive cDNA library was constructed by suppression subtractive hybridization(SSH).After screening,31 clones from 50 clones which were derived from the cDNA library were inserted by 60~400bp cDNA fragments.24 cDNA fragments corresponded to known genes and 7 cDNA fragments were unknown sequences(GenBank accession number:BG447490~447496).     

Molecular cloning of an IL-8-like CXC chemokine and tissue factor in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by use of suppression subtractive hybridization

Suppression subtractive hybridization (SSH) was performed to construct a Rainbow trout cDNA library enriched in sequences up-regulated in head kidney leukocytes after lipopolysaccharide (LPS) and tumour necrosis factor alpha (TNFalpha) stimulation. Random sequencing of fifty clones allowed the identification of a Rainbow trout interleukin 8 (IL-8)-related CXC chemokine, as well as the Rainbow trout tissue factor (TF) precursor. Expression of both the IL-8-like chemokine and TF is induced after LPS and TNFalpha stimulation, indicating that they are associated with inflammatory responses in fish, as has been suggested in mammals. These results confirm the potential of SSH to identify cytokines and immuno-regulatory genes in fish.     

链状亚历山大藻生长衰亡相关基因的筛选

采用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建了衰亡期的链状亚历山大藻(Alexandriumcatenella)特异表达的cDNA文库。共获得800个克隆,利用巢式引物进行PCR筛选,最终确定阳性克隆556个。利用斑点杂交技术对这些阳性克隆进行差异筛选,获得差异表达克隆160个。测序后得到片段125个,经过归类,获得21种序列,其中6种在NCBI中经Blast,获得功能基因与其匹配,这些功能基因分别是CHK1类似检测点蛋白(checkpoint-like protein)、核酸外切酶复合体、谷氧还蛋白、Na+/K+ATPase、叶绿体中的一个开放阅读框和pG1蛋白,其他blast无同源序列,可能为新基因。推测链状亚历山大藻的衰亡过程可能涉及到DNA损伤、mRNA降解过程、氧化还原状态的变化、离子动态平衡的变化以及叶绿体一些生理状况的变化等过程。