利用正交法确定测定意大利蜜蜂幼虫细胞色素P4500-脱乙基活性最佳反应条件

荧光分光光度法检测意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica Spinal细胞色素P450 O-脱乙基活性方便快捷、较灵敏,以7-乙氧基香豆素为底物.通过测定其产物7-羟基香豆素的荧光变化来确定细胞色素P450 O-脱乙基的活性.在利用荧光分光光度法检测意大利蜜蜂幼虫细胞色素P450 O-脱乙基活性过程...     

吡虫啉对意大利蜜蜂乙酰胆碱酯酶的亚致死效应

【目的】确定吡虫啉对意大利蜜蜂Apis mellifera的致死中浓度,探究吡虫啉对意大利蜜蜂乙酰胆碱酯酶的亚致死效应。【方法】本文采用药膜法、点滴法和饲喂法测定吡虫啉对意大利蜜蜂的毒力曲线,及蜜蜂接触吡虫啉后头部乙酰胆碱酯酶活性的变化。应用RT-q PCR技术研究饲喂LC5浓度吡虫啉后,蜜蜂乙酰胆碱酯酶基因Ace1和Ace2的m RNA相对表达量。【结果】饲喂法、点滴法和药膜法3种方法测定的吡虫啉对意大利蜜蜂的致死中浓度分别是7.15 mg/L、0.078 ng/蜂和51 ng/cm2。3种作用方式下,吡虫啉均抑制了乙酰胆碱酯酶活性;随着浓度增加,ACh E酶活性处于下降状态,但降低较少。LC5浓度的吡虫啉对蜜蜂ACh E活性具有明显影响,24 h内ACh E活性呈现增强-抑制-增强的趋势。饲喂蜜蜂LC5亚致死浓度的吡虫啉后,Ace1和Ace2被诱导表达,但在1、2和16 h与对照无明显差异。【结论】亚致死浓度的吡虫啉对蜜蜂乙酰胆碱酯活性具有抑制作用,并且存在明显的剂量效应和时间效应,对Ace1和Ace2具有诱导效应,酶活性水平和m RNA相对表达水平不一致。     

小峰熊蜂头部乙酰胆碱酯酶测定条件的优化及其对六种常用杀虫剂的敏感性

小峰熊蜂Bombus hypocrita是我国优势熊蜂种群之一, 因其易于饲养、 群势较强且授粉性能优良而成为我国设施农业常用优良授粉蜂种, 但常受到以乙酰胆碱酯酶(AChE)为靶标酶的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的危害。 为合理规避这两类杀虫剂对熊蜂的危害, 同时也为完善熊蜂授粉配套技术和保护野生熊蜂资源提供理论基础, 本研究利用正交试验对小峰熊蜂头部乙酰胆碱酯酶活性的测定条件进行了优化, 并明确了6种常用有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的影响。结果表明： 各测定因素对小峰熊蜂乙酰胆碱酯酶活性测定影响的大小顺序依次为： 酶浓度＞pH＞温度＞底物浓度＞反应时间; 小峰熊蜂头部乙酰胆碱酯酶活性的最适反应条件为： 酶浓度0.25 g 蛋白质/L, 底物浓度0.8 mmol/L, pH值7.5, 温度40℃, 反应时间5 min。毒死蜱、 三唑磷、 丙溴磷、 异丙威、 仲丁威和残杀威6种杀虫剂对小峰熊蜂头部乙酰胆碱酯酶离体抑制作用均呈现明显的剂量-效应关系, 其抑制中浓度IC₅₀分别为0.39, 1.79, 0.42, 0.04, 0.43和0.63 mmol/L。这6种杀虫剂对小峰熊蜂AChE抑制作用的强弱依次为： 异丙威＞毒死蜱＞三唑磷＞仲丁威＞残杀威＞丙溴磷, 即小峰熊蜂对异丙威最敏感, 而对丙溴磷的敏感性最弱。     

黑翅土白蚁乙酰胆碱酯酶最佳反应体系的建立及药剂敏感度比较

用正交试验方法研究了酶浓度、底物浓度、反应体系pH值、反应温度、反应时间5个因素对黑翅土白蚁Odontotermes formosanus (Shiraki)乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定的影响。通过对正交试验结果进行极差和方差分析,明确了测定黑翅土白蚁AChE活性的最适反应条件是酶浓度为12.5 g/L,底物浓度为8 mmol/L,pH值8.0,反应温度40℃,反应时间5 min。此外,研究了6种药剂对黑翅土白蚁体内AChE活性的影响。结果表明：灭多威、辛硫磷、三唑磷、丙溴磷、马拉硫磷和氧化乐果6种药剂对黑翅土白蚁AChE抑制中浓度(IC₅₀)分别为3.52×10^-4,1.86×10^-3,5.13×10^-3,9.55×10^-4,8.81×10^-3,和1.39×10^-2 mol/L。在3.3×10^-7～5×10^-3 mol/L的浓度范围内,上述6种药剂对黑翅土白蚁体内AChE活性的抑制作用都具有明显的剂量效应关系。     

正交法测定钉螺离体GPT反应的最佳条件

钉螺是日本血吸虫幼虫的唯一中间宿主, 药物灭螺是阻断日本血吸虫病传播的有效方法。由于化学灭螺药物的生产和使用对环境和非靶标生物均产生严重污染和毒害作用, 因而低毒、易分解的植物灭螺药物研究受到重视,已筛选出诸如黄姜(Dioscorea zingberensis C.H.Wright, DZ)、吉祥草(Reineckea carnea, RC)等皂甙类植物灭螺剂[1,2]。     

吡虫啉对意大利蜜蜂脑乙酰胆碱受体分布的影响

蜜蜂是自然界主要的授粉昆虫; 新烟碱类杀虫剂(neonicotinoid insecticide)通过结合害虫体内乙酰胆碱受体（nAChR）使害虫致死, 是目前广泛用于田间害虫防控的杀虫剂。本研究以意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica和新烟碱类杀虫剂的代表品种吡虫啉为材料, 应用免疫组织化学的方法, 研究了正常成年蜜蜂脑内蘑菇体及视叶nAChR-α7的表达和分布; 分析了亚致死剂量新烟碱类杀虫剂吡虫啉对nAChR-α7表达和分布的影响。结果表明, nAChR-α7在正常蜜蜂脑蘑菇体和视叶中均可检测到, 在蘑菇体中分布相对较少, 但在视叶分布丰富。吡虫啉对nAChR-α7在视叶的表达和分布有显著抑制作用, 但对蘑菇体nAChR-α7的表达没有显著影响。结果提示, 新烟碱类杀虫剂吡虫啉除了文献报道的抑制nAChR的表达外, 还能抑制nAChR-α7的表达量, 这是新烟碱类杀虫剂作用机制的新发现。     

原子力显微观察巯基反应剂对乙酰胆碱酯酶立体结构的影响

目的:研究巯基及二硫键对乙酰胆碱酯酶(AChE)高级结构的作用。方法:将与巯基反应剂GSH和DTT作用前后的AChE重组到磷脂膜上,置于原子力显微镜下观察,扫描方式为空气中接触模式。结果:天然的AChE直径不均一,既有大粒子也有小粒子,平均最大直径(95±44)nm,平均半径(43±17)nm,平均高度(9.25±2.62)nm;与GSH反应后的AChE整体粒径明显变小,最大直径(31±13)nm,平均半径(15±4)nm,平均高度(4.02±0.67)nm;与DTT反应后的AChE边界模糊。结论:GSH可将AChE多聚体还原为单体;相同浓度的DTT作用不明显。     

繁殖寄主对赤眼蜂羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的影响

通过测定赤眼蜂Trichogramma羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性、对底物的亲和力以及对抑制剂的敏感度研究了繁殖寄主对松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi和螟黄赤眼蜂T.chilonis的影响。柞蚕卵和米蛾卵繁殖的赤眼蜂羧酸酯酶对底物的亲和力有不同程度的影响,柞蚕卵繁殖的赤眼蜂羧酸酯酶对α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯的亲和力最高是米蛾卵的2倍以上。繁殖寄主对乙酰胆碱酯酶对底物亲和力没有明显的影响。米蛾卵繁殖的松毛虫赤眼蜂羧酸酯酶活性明显高于柞蚕卵繁殖的种群,而米蛾卵繁殖的螟黄赤眼蜂种群羧酸酯酶的活性明显低于柞蚕卵繁殖的种群。用柞蚕卵繁殖的松毛虫赤眼蜂种群对对氧磷的敏感度明显低于米蛾卵繁殖的种群,而增效磷则正好相反。繁殖寄主对松毛虫赤眼蜂吉林种群乙酰胆碱酯酶对DDVP和毒扁豆碱的敏感度没有明显的影响,而在松毛虫赤眼蜂广东种群和螟黄赤眼蜂中,柞蚕卵繁殖的种群乙酰胆碱酯酶对DDVP和毒扁豆碱的敏感度明显低于米蛾卵繁殖的种群。     

正交试验优化精制酪氨酸的工艺条件

采用正交实验法 ,将所得实验数据进行统计分析 ,对结晶法精制酪氨酸的工艺条件进行优化。结果表明 :在酪氨酸粗品质量分数为 6 %的溶液中 ,脱色剂ζ(活性炭∶活性白土 ) =3∶1,氨水的浓度为 5 % ,反应终点pH值为 2 .0 ,中和反应恒温水浴的温度为 6 0℃的工艺条件下 ,粗品经一次脱色、结晶就能获得品质合格的产品     

抗性小菜蛾的乙酰胆碱酯酶敏感性

用FAO推荐的点滴法测定了小菜蛾Plutella xylostella(Linn.)对马拉硫磷和西维因的抗药性,并对抗性?和敏感(S)小菜蛾幼虫的胆碱酯酶(ChE)的性质、活性、动力学和抑制作用进行了研究.广州天河、上海梅陇的小菜蛾对马拉硫磷的抗性分别是江西南昌种群的113.8和27.4倍;它们对西维因的抗性是》3.1倍.R幼虫ChE对乙酰胆碱(ATCh)、丙酰胆碱(PrTCh)和丁酰胆碱(BuTCh)的活性分别是S幼虫的0.3、0.7和9.9倍;它们的V_max分别是0.4、1.4和7.0倍;K_m分别是209.1,87和37.8倍.毒扁豆碱、西维因、对氧磷、敌敌畏和残杀威对R幼虫AChE的抑制中浓度I₅₀,分别是S幼虫的333.3,66.7,17.2,12.5和10.0倍.对氧磷、敌敌畏、残杀威和西维因对R幼虫的双分子速率常数K₁,分别是S幼虫的126.4,86.5,32.9和12.3倍.由此可见,AChE敏感度降低是小菜蛾对有机磷和氨基甲酸酯产生抗性的主要机理之一.本文中还讨论了防治抗性小菜蛾的策略.     

蜜蜂人工代用花粉中适宜钙磷水平的初步研究

钙磷是蜜蜂饲粮中必需的常量元素。为了探讨蜜蜂人工代用花粉中适宜的钙磷水平,本试验选取蜂王、群势基本一致的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica Spinola 70群,随机分为14个组,每组5群蜂,前12组饲喂采用均匀设计法配制的不同钙磷水平的人工代用花粉。第13组饲喂不加钙磷的人工代用花粉为负对照,第14组饲喂纯油菜花粉为正对照。试验从春繁开始,到刺槐流蜜期结束为止。试验期间测定蜂群的采食量、蜂群群势、幼蜂初生重,成蜂蜂体组织内钙磷含量。结果表明:当人工代用花粉中钙磷水平分别为0,0.65%时,蜂群的采食量、蜂群群势、幼蜂初生重均取得最大值;成蜂蜂体组织内钙含量与人工代用花粉中钙磷含量成正相关,成蜂蜂体组织内磷含量与人工代用花粉中钙磷含量之间没有相关性。     

意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)与中华蜜蜂(Apis cerana ceraca)的生态位比较

为了明确中华蜜蜂和意大利蜜蜂在皖南山区生态适应性,研究两种蜜蜂的食物生态位、时间生态位和空间生态位及其差异,结果是中蜂与意蜂食物(蜜源植物)资源生态位宽度分别是 0.923、0.765,中蜂对蜜源植物采集喜好性差异小,而意蜂差异大,中蜂对意蜂生态位重迭为0.160,中蜂对意蜂生态位相似性为0.755;油菜花期,中蜂与意蜂时间资源生态位宽度分别是0.879、0.801,枇杷花期,分别是0.760、0.677,中蜂与意蜂的空间资源生态位宽度分别是0.797、0.670.中蜂3种生态位宽度均大于意蜂,中蜂三维生态位值是意蜂的1.61倍和1.57倍.表明中蜂在皖南山区生态适应性比意蜂强.     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂夏季高温下为长季节栽培设施西瓜授粉行为观察

应用中华蜜蜂和意大利蜜蜂为设施西瓜授粉,对其高温条件下的授粉行为进行对比观察。结果表明:两种蜜蜂的授粉行为相似,但在访花时间、访花间隔、访花频率和采集专一性等行为上存在差异。中华蜜蜂和意大利蜜蜂的棚内活动时间分别为5.54 h和5.50 h,与西瓜开花时间基本重合;意大利蜜蜂的单花访花时间3.03±0.17 s比中华蜜蜂的访花时间2.66±0.15 s长,而访花间隔3.22±0.24 s显著低于中华蜜蜂的4.07±0.30 s,访花频率9.53±0.38朵/min显著高于中华蜜蜂的8.09±0.29朵/min。中华蜜蜂在5∶00-7∶00、7∶00-9∶00、9∶00-11∶00采集花粉中西瓜花粉的比例分别为11.03%、13.31%和12.62%,意大利蜜蜂在相应时间段采集花粉中西瓜花粉的比例分别为54.31%、55.97%和32.32%,差异显著。本研究认为中华蜜蜂和意大利蜜蜂都能高效地完成设施西瓜的授粉任务,而且意大利蜜蜂在西瓜授粉上更具优势。     

意大利蜜蜂工蜂中肠SNP和InDel突变位点的挖掘及分析

本研究利用已获得的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的转录组数据对意蜂的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion, InDel）突变位点进行挖掘和分析,共鉴定到232 678个SNP位点,其中发生转换和颠换的SNP位点数分别为196 087和36 591个;最丰富的突变类型是G/A,最少的突变类型为T/G;分布在内含子的SNP位点最多,其次为外显子和基因间区;密码子突变类型为同义突变的SNP位点数最多,其次是非同义突变、终止子增加和终止子减少;此外,SNP位点所在基因可注释到 50个 GO条目和351条KEGG通路。共鉴定到38 715个InDel位点,最丰富的突变类型为移码插入,其次是移码缺失;分布InDel位点数较多的基因组区域为内含子和基因间区;另外,InDel位点所在基因可注释到50个功能条目和340条通路。研究结果丰富了西方蜜蜂Apis mellifera的SNP和InDel位点信息,并为开发和利用意蜂的新型分子标记提供基础。     

中国意大利蜜蜂微卫星遗传多态性

为了分析我国不同生态条件下意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica（简称意蜂）的基因特征,对品种间基因交流或基因渗入现象进行监测,完成对我国主要地区意蜂多样性水平的评价。本研究利用10对微卫星（SSR）引物分析了来自我国黑龙江等14个省市自治区31个采集点的意蜂样品的遗传多态性,并与来自德国的喀尼阿兰蜂A. m. carnica（简称喀蜂）和来自美国的意蜂A. m. ligustica进行比对。通过NTSYS-pc2.1和popGene32软件对SSR数据进行多态性分析。结果表明：10对SSR引物中8对表现出较高的遗传稳定性,可作为意蜂遗传多态性标记。遗传一致度在0.61以上时,浙江、四川、甘肃和云南地区的样品出现较严重分化,其他地区的意蜂样品则保持了美国原种意蜂的典型基因特征。东北和新疆地区的样品与德国喀蜂血统亲缘关系较近（遗传距离在0.18149以内）,分析主要原因可能是该地区的意蜂样品杂有黑蜂A. m. mellifera血统。据此提出应在保护各地意蜂原种特性及种群多态性的基础上,科学有效地进行高产品种的繁育。     

意大利工蜂前胃显微结构观察

通过解剖镜和扫描电子显微镜对意大利工蜂Apismellifera ligusticaL.前胃的形态结构进行了观察,发现前胃包括前胃瓣和前胃管两部分。前胃瓣是由4个瓣片环围而成,球形,在蜜囊中,每个瓣片的长度约为0.8mm,前端为三角形结构,可以运动,边长约为0.35mm,三角形的前缘有较长的毛形结构。在每个三角形顶端各有一个直径约为50μm瘤形突起。前胃瓣最大孔径为0.89～1.00mm,具有调整和控制食物进入中肠的功能。前胃管是一直径0.01～0.02mm的较为柔软的管道,插入中肠5mm,该结构可防止中肠食物的倒流。前胃瓣上有7种毛状结构,分布在前胃瓣的不同部位,该结构的功能是分离和过滤、捕捉和感觉功能。本研究为理解工蜂前胃在消化系统中的功能和作用以及昆虫形态学和昆虫分类学提供理论依据。     

百草枯对蜜蜂寿命及抗氧化酶基因表达影响

本研究用200、400和600 mg/L的百草枯饲喂刚出房的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica Spinola工蜂,检测其对工蜂寿命及抗氧化酶基因Sod 1和Sod 2表达的影响,并以饲喂蔗糖作为对照组.结果表明:随着百草枯浓度的增加,工蜂的寿命极显著下降(P＜0.01);抗氧化酶基因Sod 1的相对表达量,随着百草枯浓度的增加而增加,其中对照组Sod 1基因的相对表达量显著低于各百草枯处理组(P ＜0.05);Sod 2基因的相对表达量,随着百草枯浓度的增加,先增加后减少,其中600 mg/L百草枯处理组Sod 2基因的相对表达量显著低于对照组和低剂量百草枯处理组(P＜0.05).     

意大利蜜蜂piR-ame-1186994的靶基因与功能分析

【目的】本研究旨在明确意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica piR-ame-1186994的调控功能;为进一步探究piR-ame-1186994的调控作用机制提供科学依据。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证piR-ame-1186994在意大利蜜蜂6日龄工蜂成虫中肠、 12日龄雄蜂成虫精巢和7日龄蜂王成虫卵巢中的表达和序列真实性。使用相关软件预测piR-ame-1186994的靶mRNA并进行GO和KEGG数据库注释;进而构建发育信号通路、能量代谢通路及细胞和体液免疫通路相关调控网络。饲喂刚出房工蜂成虫piR-ame-1186994的模拟物(mimic)和mimic-NC(阴性对照组);利用RT-qPCR检测工蜂成虫中肠中的piR-ame-1186994及其关键2个关键靶基因(YAP1和PLD2)的相对表达量。【结果】在意大利蜜蜂6日龄工蜂成虫中肠、 12日龄雄蜂成虫精巢和7日龄蜂王成虫卵巢中均扩增出piR-ame-1186994的特异性片段。piR-ame-1186994共靶向1 097条mRNA;可注释到新陈代谢过程、结合和细胞等30条GO条目以及Wnt信号通路、内吞作用和催产素信号通路等182条KEGG通路。其中;分别有36和16条靶mRNA涉及5条发育相关信号通路(mTOR, Wnt, Hippo, AMPK和Notch信号通路)和4条能量代谢相关通路(氨基糖和核苷酸糖代谢、果糖和甘露糖代谢、糖酵解/糖异生及磷酸戊糖通路)。此外;分别有29和8条靶mRNA涉及4条细胞免疫通路(溶酶体、内吞作用、吞噬体和泛素介导的蛋白水解)和3条体液免疫通路(PI3K-Akt, MAPK和FoxO信号通路)。相较于阴性对照组mimic-NC; mimic-piR组中piR-ame-1186994的表达量在1, 3和5日龄工蜂中肠中显著上调;在2和4日龄工蜂中肠中极显著上调;靶基因YAP1的表达量在1, 3, 4和5日龄工蜂中肠中极显著下调;在2日龄工蜂中肠中显著下调;靶基因PLD2的表达量在2, 3和5日龄工蜂中肠中显著下调;在4日龄的工蜂中肠中极显著下调。【结论】piR-ame-1186994在意大利蜜蜂工蜂中肠、雄蜂精巢和蜂王卵巢中存在与表达;piR-ame-1186994通过靶向和负调控YAP1和PLD2的表达潜在调节工蜂中肠发育和免疫。     

意大利蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因的克隆及其原核表达与纯化

从意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的肌肉组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法克隆蜜蜂第16号染色体上的丙糖磷酸异构酶基因的cDNA序列,将测序结果(GenBank登录号EU76098)与推导的氨基酸序列分别与GenBank中的其他物种进行同源比对分析。结果表明,该基因全长744bp,为完整的阅读框,编码247个氨基酸,成熟蛋白的理论分子量为26.89kD。比对结果显示AmTPI与家蚕、德国小镰、黄粉虫、丽蝇蛹集金小蜂、水稻等物种的基因相似性达69%以上,蛋白相似性达59%以上。将目的基因克隆到pGEX-4T-2融合表达载体上,并在大肠杆菌中得到成功表达,4h的表达量为总蛋白的42.1%。为了进一步探讨产物的酶学特性,实验还对表达产物进行纯化与浓缩。实验还构建增强型荧光真核表达质粒,为进一步研究AmTPI在真核细胞中的表达情况奠定基础。