重组创伤弧菌溶细胞素缬氨酸V201和V289突变对其活性的影响

将重组创伤弧菌溶细胞素A（recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA）第201位和第289位的缬氨酸定点突变为甘氨酸,并表达rVvhAval201gly,val289gly突变蛋白。检测突变蛋白与未突变蛋白的溶血活性、对胞内钙离子浓度、钾离子外流及对细胞损伤的影响。结果显示,与rVvhAval201gly,val289gly的溶血活性和细胞毒性均降低,诱导人类脐静脉内皮细胞（human umbilical veinendothelial cells,HUVEC）凋亡、胞内钙离子内流和钾离子外流等作用均受到抑制。实验结果表明,在创伤弧菌溶细胞素的活性发挥中,rVvhA的V201和V289两个氨基酸与该蛋白质损伤靶细胞时引起胞内外离子平衡失调有关,并能影响该蛋白质的溶血活性和细胞毒作用。     

创伤弧菌溶细胞素中类蓖麻毒素功能模序的细胞毒活性研究

创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)氨基酸序列的313-445位(Gi No.M34670)与蓖麻毒素B链(Ricinchain B,RTB)的一段高度同源,为类蓖麻毒素。基因克隆表达创伤弧菌溶细胞素类蓖麻毒素(rRicin B),Ni2+亲和层析法及透析复性法进行纯化、复性。用纯化的rRi-cin B免疫日本大耳兔获得多克隆抗体,兔抗rRicin B多克隆抗体经盐析法、分子筛纯化后,得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示,抗rRicin B多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。流式细胞术结果显示,rRicin B诱导细胞凋亡呈剂量依赖关系,多抗能够阻断其细胞毒性。至此,该工作成功制备了兔抗rRicin B的多克隆抗体,并证明了创伤弧菌溶细胞素结构基因的类蓖麻毒素功能域具有细胞毒活性,能诱导Hela细胞凋亡,且其细胞毒活性能被其多抗成功阻断。     

rVvhA作用于THP-1细胞NF-κB信号通路的研究

研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）对人单核细胞系（THP-1）NF-κB信号通路的影响。应用CCK-8法检测rVvhA对THP-1细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察rVvhA作用后细胞的形态学变化和细胞内NF-κB p65的核转移情况;应用流式细胞仪和Westernblot检测rVvhA作用后细胞浆内和细胞核内NF-κB p65的表达情况;ELISA检测rVvhA作用于细胞后TNF-α、IL-6表达含量的变化。试验结果显示：rVvhA能够呈时间–剂量依赖性地抑制THP-1细胞的生长,且镜下可见明显的细胞形态学变化。激光共聚焦显示0.4 HU/mL rVvhA作用6 h后,THP-1细胞内NF-κB p65的核转移现象最明显;流式细胞仪结果显示0.6 HU/mL rVvhA作用2 h后,细胞内总的NF-κB p65表达量达到高峰;Western blot检测显示0.6 HU/mL rVvhA作用4 h时细胞核内NF-κBp65蛋白含量最高;ELISA显示TNF-α的表达在rVvhA作用的适当范围内呈时间–剂量依赖性变化;IL-6在0.6 HU/mL rVvhA作用时表达量最高,随后随着浓度的增加反而下降;NF-κB抑制剂能使IL-6表达量下调。实验证明rVvhA作用于THP-1细胞后能激活NF-κB信号通路,上调TNF-α、IL-6的表达,而NF-κB抑制剂能够下调IL-6的表达。     

槲皮素对血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用

本实验研究了槲皮素对人脐静脉内皮细胞株(ECV304)增殖和迁移的抑制作用。研究发现,槲皮素作用一定的时间后,能明显抑制ECV304细胞的增殖(IC50为50．08μg/ml)和迁移(IC50为7．84μg／ml),而且其抑制作用呈浓度依赖性;细胞出现凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳形成DNA条带,推测其诱导细胞发生了凋亡。     

创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定

目的 克隆创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）溶细胞素基因（υυhA）,构建原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性.方法 采用PCR技术从Vv GTC333和WZ01株DNA中扩增全长υυhA基因,T-A克隆后测定其核苷酸序列.采用pET32a质粒构建vvhA基因原核表达载体,在E coli BL21（DE3）宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rVvhA表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯rVvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果.采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot和兔抗rVvhA血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和免疫原性.结果 所克隆的vvhA基因核苷酸序列与GeneBank公布的同源性分别为96.09%和98.26%.在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rVvhA产量可占细菌总蛋白的18%.提纯的rVvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带.重组蛋白rVvhA能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合,免疫家兔可获得高效价抗体.结论 该研究成功地构建了创伤弧菌υυhA基因高效原核表达系统,所表达的rVvhA具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原.     

地鳖虫纤溶活性蛋白组分抑制血管的生成

从地鳖虫(Eupolyphaga sinesisWalke)中分离纯化出纤溶活性蛋白组分———地鳖虫纤溶活性蛋白(Fibrinolyric protein ofEupolyphage sinesis,EFP),研究其对血管生成的抑制作用。以新鲜地鳖虫为原料,采用硫酸铵分段盐析,经DEAE-纤维素和SephadexG-75柱等方法分离纯化EFP,用不同浓度的EFP作用于人微血管内皮细胞(MVEC),用MTT法测定EFP对MVEC增殖的影响,用单细胞凝胶电泳和AnnexinV-FITC/PI双荧光染色观察细胞凋亡情况,采用流式细胞术检测EFP对MVEC细胞周期的影响,并采用鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管模拟肿瘤的新生血管,检测EFP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的作用。结果表明:1)MTT法测得EFP可抑制MVEC细胞增殖,增殖抑制率达46%;2)EFP可诱导MVEC细胞凋亡,且成剂量依赖关系,用单细胞凝胶电泳法检测细胞凋亡,随着EFP浓度的增大,拖尾细胞增多;用AnnexinV-FITC/PI进行双荧光染色发现,当EFP处理浓度达2μg/ml时,出现了大量凋亡晚期细胞;3)EFP可干扰MVEC的细胞周期,出现S期和G2/M期阻滞;4)用鸡胚尿囊膜实验观察到EFP剂量为0.06mg/egg即可抑制鸡胚尿囊膜血管生成,最高抑制率可达35.8%。提示地鳖虫纤溶活性蛋白组分具有抑制血管生成的作用。     

rVvhA功能模序膜成孔的预测及细胞毒作用机制分析

利用生物信息学预测rVvhA的141-335位氨基酸片段有膜成孔模序。基因克隆表达得到95%以上纯度的rMpf,电子透射电镜观察其能够抑制Hela细胞生长且呈剂量依赖性,即0.8,1.6,2.4μg/mL rMpf作用8 h后,细胞和线粒体形态均发生凋亡和坏死改变,细胞内活性氧产生明显,线粒体膜电位下降,mPTP荧光检测膜通道孔活性增强。以上结果表明,rMpf具有诱导Hela细胞损伤的生物学活性,可通过改变膜通透性引起细胞凋亡。     

共轭亚油酸诱导人结肠癌细胞Caco-2凋亡的作用

共轭亚油酸（conjugated linoleic acid,CLA）有着多种异构体以及多种生理活性,如抗癌、减肥、抗动脉粥样硬化等。本研究主要对c9,t11-CLA和t9,t11-CLA两种异构体的混合物诱导人结肠癌细胞Caco-2凋亡的作用及可能机制进行了探讨。采用MTT方法、透射电镜观察、流式细胞术检测和RT—PCR方法,研究了CLA混合物抑制Caco-2细胞增殖,诱导Caco-2细胞凋亡的作用及可能机制。实验结果证明,c9,t11-CLA和t9,t11-CLA混合物能抑制Caco-2细胞的增殖,并可诱导Caco-2的凋亡。随着所用的CLA混合物浓度的增加以及作用时间的延长,细胞凋亡率增加。通过RT—PCR分析,Caco-2细胞中的caspase 3的mRNA的表达随着CLA混合物浓度的增加而上调。这两种CLA的混合物可抑制Caco-2细胞的增殖,诱导Caco-2的凋亡,而caspase 3的表达上调可能与细胞凋亡密切相关。     

改构苹果多糖对人结肠癌HT29细胞凋亡的影响

目的:探讨改构苹果多糖(modified apple polysaecharides,MAP)对人结肠癌HT29细胞凋亡的影响及其机制.方法:采用MTT法观察不同浓度MAP对HT29细胞增殖的影响;TUNEL法和流式细胞术研究MAP对HT29细胞凋亡的作用;Western Blot法检测给予不同浓度MAP后,HT29细胞中凋亡相关蛋白caspase3,8,9、Bax和Bcl-2表达的变化.结果:与对照组相比,MAP对HT29细胞增殖有明显的抑制作用且能诱导HT29细胞的凋亡;MAP可促进HT29细胞caspase 3,8,9及Bax的表达,降低Bcl-2的表达,且均呈剂量依赖性.结论:MAP可以通过内部和外部途径诱导HT29细胞凋亡.     

哇巴因对人血管内皮细胞死亡和钠泵α1、β1,亚单位表达的影响

目的：研究钠泵抑制剂哇巴因（ouabain）对人血管内皮细胞死亡的影响及其作用机制。方法：以脐静脉内皮细胞系ECV304为靶细胞,应用MTT实验检测哇巴因对细胞生长的作用 采用Hoechst33342/PI双荧光染色、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等分析细胞死亡特征,半定量RT-PCR法检测钠泵α1和β1亚单位mRNA的表达。结果：哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长。10μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死 0.1μmol/L哇巴因作用24～48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、分布于核膜内缘、DNA裂解等凋亡特征。哇巴因能明显上调ECV304细胞钠泵α1亚单位mRNA的表达,下调β1亚单位mRNA表达,且两者均呈时间依赖性。结论：哇巴因能诱导人血管内皮细胞ECV304死亡,其上调钠泵α1亚单位表达、下调β1亚单位表达,可能与亚单位介导信号传递、降低细胞黏附有关。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.