判断基因中点突变使用的寡聚核苷酸探针

本文简明扼要地介绍了人工合成寡聚核苷酸探针的设计原则,以及用 ³²P标记等方法。同时还从理论上阐述了19聚体探针在生物实验使用中的合理性,并强调在检测基因的点突变时,设计人工合成的寡聚核苷酸探针应将点突变位点置于探针序列的中间为宜。在选择序列时,要注意避免发生G-T错配,这样有利于鉴别基因的点突变。     

寡聚核苷酸探针在近交系小鼠遗传检测中的应用

用两个非放射性标记的寡聚核苷酸探针(GGAT)4和(GTG)5制作BALB/c、C57BL/6J、DBA/2、C3H等4种近交系小鼠的DNA指纹图,比较了两种探针在近交系小鼠遗传检测应用中的重复性和稳定性。结果表明,两种探针对上述4种近交系小鼠产生的DNA指纹图的图带数均为8～12条,具有良好的多态性。品系内的平均DNA指纹图相似系数(-x)在0·92～1·00的范围内,具有相同指纹图的概率(P)均在0·31以上,极显著地高于品系间的相似系数(0·22～0·39)和相同指纹图的概率(P<1·07×10-4)。说明(GGAT)4和(GTG)5两种寡聚核苷酸探针均可用于制作近交系小鼠的DNA指纹图,以对其进行遗传检测。用两种不同的探针进行DNA指纹分析,可以检出基因组中更多的个体特异性信息,结果更加可靠。     

两种末端标记的寡聚核苷酸探针的比较研究

本文利用[α-³²P]-dATP 和 [γ-³²P]-ATP分别对寡聚核苷酸的3’-末端及5’-末端进行标记,研究这两种标记方法的技术途径,并结合斑点杂交,比较这两种末端标记的探针的灵敏度及特异性。结果表明:[α-³²P]-dATP虽可在寡聚核苷酸的3’-OH末端标上多个[³²P]-dAMP分子,但所得标记探针的杂交灵敏度及杂交体的稳定性均不及[γ-³²P]-ATP标记5’-末端制备的寡聚核苷酸探针。因此,当实验需要极高灵敏度的寡聚核苷酸探针时,以选择[γ-³²P]-ATP标记其5’-末端为宜。     

应用荧光原位杂交(FISH)技术研究黑叶猴染色体易位

本文应用染色体荧光原位杂交(FISH)技术,利用人9号和14号染色体特异探针,对深低温冻存和长期传代的黑叶猴细胞株染色体畸变进行了分析.确定在长期冻存和传代过程中,一些黑叶猴细胞在No.12和No.17染色体之间发生了易位,一条 No.17染色体发生断裂,断裂点在17q13,断裂片段17q13-17qter易位到一条 No.12染色体长臂末端,形成一条小的中着丝粒的和一条具较长长臂的衍生染色体即 der(17) 和 der(12).结果表明,荧光原位杂交技术用人染色体特异探针不仅能检测出人类染色体畸变,也能有效地检测灵长类动物染色体畸变.     

14个染色体区带特异性探针池的构建

本文运用人类染色体显微切割和ＰＣＲ技术,成功地构建了１４个染色体区带特异性探针池,并通过染色体原位杂交证明它们均分别来源于相应的被切割的染色体区带。     

荧光标记寡核苷酸探针及其应用

寡核苷酸探针的标记非常重要。近年来 ,用荧光染料对探针进行非放射性标记受到很大重视 ,并取得了迅速发展 ,广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。以下就寡核苷酸探针的荧光标记及其应用作一简要综述。     

内毒素耐受对核苷酸结合寡聚化结构域2信号通路的影响

为研究内毒素耐受对核苷酸结合寡聚化结构域2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2,NOD2)信号通路的影响,将小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7分为两组,分别给予小剂量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(100ng/mL)或磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)预处理20h,建立内毒素耐受组和对照组。每组细胞分别给予大剂量LPS(1 000ng/mL)或热灭活烟曲霉孢子刺激,于刺激后0、2、6、12、24h采用定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测细胞NOD2、受体相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2,RIP2)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)mRNA表达;采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)和TNF-α浓度。结果显示,内毒素耐受组无论是大剂量LPS还是热灭活烟曲霉孢子刺激均不能增加NOD2、RIP2和TNF-αmRNA表达及细胞上清液中IL-8、TNF-α浓度;而对照组大剂量LPS和热灭活烟曲霉孢子刺激均可提高NOD2、RIP2和TNF-αmRNA表达及细胞上清液中IL-8、TNF-α浓度,尤以刺激后12h增加显著,与刺激前(0h)比较,差异有统计学意义(P0.05)。结果提示,内毒素耐受可能对NOD2信号通路有抑制作用。     

应用G显带染色体荧光原位杂交（FISH）技术研究复杂的染色体易位

建立常规Ｇ显带染色体标本的荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术,用于分析患者复杂的染色体易位。原位杂交前,用甲醛固定Ｇ显带标本,是获得良好显带和荧光杂交效果的关键步骤。仅用常规细胞遗传学方法分析,显示一例习惯性流产患者的核型为４６,ＸＸ,ｔ（１;５;１２）（１ｐｔｅｒ→１ｑ２５：：１２ｑ２４→１２ｑｔｅｒ;５ｑｔｅｒ→５ｐ１１：：１ｑ２５→１ｑｔｅｒ,１２ｐｔｅｒ→１２ｑ２４：．５ｐ１１→５ｐｔｅｒ）,而采用本方法确定患者的核型实际为４６,ＸＸ,ｔ（１;５,１２）（１ｐｔｅｒ→１ｑ２３：：１２ｑ２２→１２ｑｔｅｒ,５ｑｔｅｒ→５ｐ１１：：１ｑ２５→１ｑｔｅｒ;１２ｐｔｅｒ→１２ｑ２２：：１ｑ２３→１ｑ２５：５ｐ１１→５ｐｔｅｒ）。结果表明,新建立的Ｇ显带染色体荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术能更有效地检测患者复杂的染色体易位。     

用间期荧光原位杂交检测卵巢癌细胞中X染色体数目的异常

为了探讨用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）检测卵巢癌细胞中性染色体拷贝数目异常的实验方法及其应用价值,收集18例新鲜卵巢癌组织标本,以Biotin标记的X染色体α-卫星DNA（pBamX7）探针与经处理的标本进行卵巢癌细胞核的原位杂交,分别用Avidin-FITC和Anti-avidin进行信号的检测与放大,PI复染。于Olympus AX-70型荧光显微镜下,通过WIB滤光镜观察杂交信号及其细胞核背景,并统计卵巢癌细胞核中的杂交信号颗粒数量。在显微镜下可见以Biotin标记的pBamX7探针显示绿色杂交信号,细胞核背景经PI复染显示桔红色;发现11/18（61%）卵巢癌标本中X染色体拷贝数增加,其余7例（39%）无拷贝数增加。X染色体拷贝数目增多在卵巢癌中有一定比例的发生频率,其在促进卵巢癌发病及其发展过程中起到某种作用,其意义值得进一步研究。     

苜蓿种质间染色体多态性的荧光原位杂交检测

利用染色体荧光原位杂交技术(FISH),将3种重复序列5S rDNA、45S rDNA和C0t-1 DNA用不同荧光物进行标记,对我国10个不同地理来源的苜蓿种质(Medicago sativa L.;2n=4X=32)进行了染色体多态性检测。结果表明,利用以上重复序列可以较好地将苜蓿32条染色体区分为16对特征不同的染色体,10份不同种质材料FISH带纹特征表现高度相似,比较不同种质间同源染色体重复序列杂交特征,揭示出种质群体内和群体间多态性染色体的存在,其中不同的同源染色体多态性表现不尽一致,1号染色体(随体染色体)多态性最高,10份材料中检出7个多态型,3、4、15号染色体保守性较强,在不同种质间表现为单态,其他染色体多态性居中。对在地理分布上自西向东的10个材料进行染色体多态性比较,结果显示分布于西藏、新疆以及分布在辽宁的材料部分染色体多态型显著区别于其他材料。     

用染色体原位杂交技术定位RFLP探针Fr.3-42于16p13

限制性片段长度多态性(RFLP)探针Fr.3-42(第九届人类基因定位国际会议编号D1(?)S21)为一长1.9kb的人类单拷贝EcoRI/HindⅢ片段,本实验采用染色体原位杂交方法,将该探针定位于16号染色体短臂末端(p13)。在另一研究中已证实Fr.3-42与人α-珠蛋白基因紧密连锁。     

不同地域乌拉尔甘草基因组的FISH分析与染色体识别

在核型分析与染色体识别基础上,分别以番茄45S和5S rDNA为探针,对3种不同地域的乌拉尔甘草进行FISH分析.结果表明:内蒙古鄂托克前旗的乌拉尔甘草核型公式为2n=2x=16=6m+10sm (2SAT),新疆阿勒泰地区的乌拉尔甘草核型公式为2n=2x=16=4m+12sm(2SAT),内蒙古喀喇沁旗乌拉尔甘草核型公式为2n=2x=16=4m+12sm(2SAT);其第8染色体均带有随体.3种乌拉尔甘草基因组内均有1对5S rDNA和1对45S rDNA杂交位点.核型分析显示,5S rDNA杂交位点均位于第2染色体的短臂部位,45S rDNA杂交位点均位于第8染色体的次缢痕和随体部位.45S与5S rDNA在3种乌拉尔甘草中期分裂相上的位点数和分布情况高度一致,表明来自3种不同地域的乌拉尔甘草在染色体结构水平上没有较大的分化.     

棉花细菌人工染色体的荧光原位杂交(BAC-FISH)技术

细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC-FISH)技术是植物染色体识别、物理作图等分子细胞遗传学研究的重要工具,但对于某些物种尤其是多倍体植物,由于大量重复序列的存在等问题,使得该技术应用受到很大的限制.通过选择棉花分子遗传图中高重组区的微卫星位点(simple sequence repeats,SSR)标记的策略,筛选到不含或含有少量重复序列的细菌人工染色体(BAC)克隆,同时,在通用FISH技术程序基础上,通过改进发根、变性、洗脱条件等步骤,构建出适合于棉花的BAC-FISH技术,简化了操作流程的同时,获得稳定的杂交结果及较高的检出率;并通过将一随机获得的BAC进行染色体的物理定位,进一步引入双探针、双色及重复杂交技术,显示了该技术的成熟与良好的应用前景和价值.     

植物染色体分带及其荧光原位杂交技术研究进展

染色体分带和荧光原位杂交技术是植物研究中较重要和常用的技术手段。从它们的产生开始一直不断发展,已应用到植物研究中的很多方面。介绍了这两个技术的发展、原理和在植物研究中的进展。     

利用染色体区段混合BAC探针鉴定食管癌细胞中的染色体畸变

染色体畸变是恶性肿瘤细胞的重要遗传学特征, 文章旨在应用BAC DNA克隆鉴定食管癌细胞中的染色体臂和染色体区段的畸变。针对染色体各区段选取5~10个1 Mb BAC DNA, 分别混合制备成特定染色体区段的BAC DNA混合克隆, 然后将染色体臂上覆盖所有区段的上述混合克隆进一步混合制备成特定染色体臂BAC DNA混合克隆。利用简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(Degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)标记染色体臂探针, 利用切口平移法(Nick translation)标记染色体区段探针, 并对食管癌细胞中期染色体进行荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)分析。正常人外周血淋巴细胞中期染色体FISH结果显示, 上述方法标记的探针具有较高的特异性。进一步利用染色体臂混合探针, 确定了多个食管癌细胞中的染色体重排所涉及的特定染色体臂; 利用染色体区段混合探针, 鉴定出KYSE140的t(1q;7q)衍生染色体中1q上的断点范围位于1q32-q41。文章成功建立了1 Mb BAC DNA混合克隆探针标记技术, 并鉴定出多个食管癌细胞中的染色体臂和染色体区段畸变, 不仅为利用M-FISH技术鉴定肿瘤细胞中的染色体畸变提供了更为准确的方法, 而且还可能进一步将该法推广应用于恶性血液病的核型分析以及产前诊断。     

用万能引物PCR法从YAC中分离制备荧光原位杂交探针的研究

报道了一种从微量且未知碱基顺序的YAC DNA中制备FISH探针的新方法——万能引物PCR(UP PCR),即把复性后的UP-Linker连接于PFGE分离后经Alu Ⅰ酶切的YAC DNA上,再用UP对其进行PCR扩增和标记。由于Alu Ⅰ的广谱性和UP与Linker长度不同等,使该法能根据PCR效率调节扩增产物的广泛性向特异性的转变,且产物能覆盖YAC嵌入DNA的全长。此法制备的人21号染色体FISH探针,特异性强,杂交信号明亮,21号染色体的检出率高。该法稳定简便。     

基于GISH的甘蔗与斑茅F1染色体遗传与核型分析

斑茅在甘蔗育种的利用是现代甘蔗育种种质创新的热点,育种者期望把斑茅中优异的特性通过杂交渗透到甘蔗中。甘蔗与斑茅的F1是斑茅利用研究的难点也是基础。本研究利用基因组原位杂交技术(GISH)分析甘蔗与斑茅的F1染色体构成和核型,探讨甘蔗与斑茅F1染色体的遗传行为。GISH结果表明,甘蔗与斑茅杂交F1的染色体众数68~69条,其中40条来自甘蔗热带种Badila,28~29条来自海南斑茅,未发现有染色体的交换或易位现象。参试材料大部分染色体都属于中部着丝点(m)的染色体,少数为近中部着丝点(sm),YCE95-41核型属2B型,其余的核型都为1B型。甘蔗与斑茅的染色体按n+n的方式传递给F1,本研究结果为斑茅种质在甘蔗育种中的利用及其杂交后代染色体细胞遗传研究提供参考依据。     

荧光原位杂交在膀胱癌检测中的应用进展

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤.目前膀胱癌的治疗效果不容乐观,因此肿瘤的早期诊断、早期治疗显得尤为重要.本文介绍了荧光原位杂交技术在膀胱癌早期诊断及预后监测应用中的研究进展.     

分子灯标:用于基因检测的荧光杂交探针

随着基因工程技术应用的日趋广泛,如何快速简便准确地检测出基因序列变得日益重要。目前,一种新型的基因检测探针——分子灯标（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ）诞生了。它是在ＤＮＡ杂交技术和荧光共振能量转移原理的基础上开发出来的［１］,可以实现对基因序列的精...     

玉米B染色体特异RAPD分子标记的染色体定位

玉米B染色体特异RAPD分子标记的染色体定位