蓝藻固氮酶钼铁蛋白的研究

改进了蓝藻固氮酶的分离、提纯方法。首次用小型厌氧聚丙烯酰胺凝胶制备电泳法,代替常用的层析法,获取了电泳纯的蓝藻固氮酶钼铁蛋白,简化了程序,缩短了实验周期。SDS凝胶电泳和分子筛凝胶过滤测定分子量结果表明,钼铁蛋白分子量为360,000,由4个分子量为90,000的同一类型亚单位构成。每个钼铁蛋白分子含1个钼,18个铁和3290个氨基酸残基。其中酸性氨基酸占优势。研究了柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)固氮酶粗提物和钼铁蛋白的某些特性,其结果是:米氏常数为3.33×10~(-3)大气压乙炔,等电点为5—5.5。紫外、可见光谱与其它固氮生物的类似。盐对蓝藻固氮酶较之对其它固氮生物的固氮酶有更大的抑制作用。     

铁钼辅因子激活氧钝化钼铁蛋白的初步研究

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白氧钝化后,未断裂出任何含钼、铁原子的断片。用有机溶剂从钼铁蛋白中提取得到的铁钼辅因子(FeMoCo)可以激活被氧钝化了的钼铁蛋白,使其还原乙炔能力得到部分或完全恢复。这种激活作用的效率随着钼铁蛋白氧钝化程度的加深而降低。初步结果表明,氧钝化的钼铁蛋白中最先受到损伤的可能是 FeMoCo。如果氧钝化程度进一步加剧,其它部分也可能受到损伤。     

有催化活性的固氮酶二聚态钼铁蛋白

利用离子交换层析和凝胶过滤,第一次成功地从棕色固氮菌提取液中分离出接近电泳纯的能重组固氮酶活性的二聚态钼铁蛋白。它的分子量约为150,000,每分子含钼约0.5原子。当与铁蛋白重组固氮酶时,表现出相当高的活性。这个结果对固氮酶底物络合中心的结构提供了重要的启示,指出与目前较为流行的双钼多核中心相比,含单钼的多核中心至少同样是不可忽视的可能结构。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的提纯及其某些特性的研究

用DEAE-纤维素和凝胶过滤法,可将棕色固氮菌固氮酶铁蛋白组分提纯43倍,比活性述512毫微克分子NH3／毫克蛋白·分。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检定,呈均一状态,不含色氨酸、钼。每分子铁蛋白含3．89个原子Fe,分子量约64,000。氨基酸组分分析结果表明,铁蛋白中酸性氨基酸含量为碱性氨基酸含量的一倍。在380—650毫微米区内有宽的吸收带,但无明显吸收峰。     

棕色固氮菌固氮链中的能量转化

应用Fld_(SR)天然荧光和1,5—Br—AEDANS及5—IAF荧光探针偶标记铁蛋白和钼铁蛋白作荧光测定。Fld在与铁蛋白络合时所损失能量为铁蛋白所接受。同样,铁蛋白与钼铁蛋白络合时也有能量转移现象。铁蛋白与MgATP形成复合物后仍能将能量转移给钼铁蛋白,铁蛋白与钼铁蛋白络合物间荧光标记基团距离为35～58A,铁蛋白·MgATP与钼铁蛋白间荧光标记基因距离为38～63A。     

N2和NH4^＋培养下粪产碱菌固氮酶钼铁蛋白的合成及其特性

应用柱层析和制备电泳分别将N_2和 NH_4~ 培养的粪产碱菌固氮酶钼铁蛋白(Af 1和Af 1)分离并纯化,两者理化性质十分相似。分子量分别为226 kD和 222 kD;α亚基和β亚基分子量分别为57 kD和60 kD;氨基酸种类相同,总残基数分别为1790和1750;每分子Af 1和Af 1均含有2个原子Mo和32个原子 Fe;金属原子簇的氧化还原当量数为6。Af 1的比活性为 1477 nmolC_2H_4 mg~(-1)protein min~(-1),Af 1无活性;分子结构两者有差异。     

固氮酶内部结构揭秘

固氮酶由钼铁蛋白和铁蛋白组成 ,钼铁蛋白包含ＦｅＭｏｃｏ和Ｐ Ｃｌｕｓｔｅｒ。为解释固氮机理 ,Ｋｉｍ等 ( 1 992 )、Ｐｅｔｅｒｓ等 ( 1 997)和Ｍａｙｅｒ等 ( 1 999)分别解析出分辨率为 2 8 、2 .0 和1 .6 的钼铁蛋白晶体结构。Ｅｉｎｓｌｅ等 ( 2 0 0 2 )又获得了 1 .1 6 的钼铁蛋白结晶 ,在对其进行结构解析后发现 :ＦｅＭｏｃｏ的内部有一个轻的原子与六个铁原子键连接。此轻原子不可能是硫 ,最可能是氮 ,但不排除是碳或氧的可能。已有极好的证据表明ＦｅＭｏｃｏ是固氮酶的底物结合位点和还原中心 ,但底物是如何结合到ＦｅＭｏｃ…     

电子传递促进的ATP水解

铁蛋白在结合MgATP时,MgATP基本上不水解,只有在与钼铁蛋白结合并传递电子给钼铁蛋白时,MgATP才酶促水解为MgADP和Pi(磷酸根),电子传递和ATP的水解是两个快速的偶联过程。[Fe_4S_4(SPh)_4]~(-2)     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白两种聚合体的研究

 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白八聚体相当于两个钼铁蛋白四聚体的聚合体。在细胞生长过程中,胞内钼铁蛋白两种聚合体的相对含量出现规律性变化:在对数期,细胞固氮酶比活力成上升趋势,而钼铁蛋白主要以高活力的四聚体形式存在;在对数期结束至稳定期,细胞固氮酶比活力下降至一个低水平的稳定值,此时的钼铁蛋白基本上为八聚体形态。在细胞固氮生长时,向培养基中加入过量氨可明显地导致钼铁蛋白由四聚体向八聚体的转化。我们推断,生长过程中胞内钼铁蛋白聚合态的变化可能是调节固氮酶活力的一种方式。胞外,钼铁蛋白的两种聚合态可以相互转化。     

纯化柱胞鱼腥藻(Anabaena cylindrca)固氮酶组份(铁蛋白)的厌氧制备电泳法

各种固氮生物的固氮酶对氧都很敏感,无论是制备固氮酶的组份Ⅰ(钼铁蛋白)或组份Ⅱ(铁蛋白),也无论采取什么方法(如DEAE-纤维素层析法、硫酸鱼精朊沉淀法、胶滤、制备凝胶电泳等等)都必需在严格厌氧条件下进行,铁蛋白对氧更加敏感,因此要获得较纯而又具活力的铁蛋白,其分离、纯化过程既要严格厌氧又要迅速。到目前为止,仅红螺菌(Rhodospirillum rubrum)和棕色     

不同底物与固氮酶及其钼铁蛋白相互作用的荧光光谱分析

 本文研究了不同底物(N_2,H_2,N_2O,NaN_3,C_2H_2)对棕色固氮菌固氮酶及其钼铁蛋白荧光光谱的影响。结果表明,上述底物均能络合在钼铁蛋白及固氮酶上,但络合程度不同,从而为固氮酶系统有多个不同的底物络合中心,底物络合中心在钼铁蛋白分子上,铁蛋白对钼铁蛋白有变构作用,提供了光谱学证据。     

柱孢鱼腥藻的铁蛋白与棕色固氮菌的钼铁蛋白的交叉互补作用

纯化的柱孢鱼腥藻铁蛋白能够与棕色固氮菌的钼铁蛋白有效地交叉反应,展现较高的活性。此异源交叉反应的乙炔还原比活及放氢比活,分别是蓝藻同源互补比活的83.8及66.7％。比较藻铁蛋白与菌钼铁蛋白异源交叉反应及藻固氮酶组分之间的同源反应的动力学特点时发现,铁蛋白对钼铁蛋白的最佳克分子比数前者(异源交叉反应)较后者(藻同源反应)为高,前者为5,后者为1;但反应的时间进程两者差别不大。     

柱孢鱼腥藻的铁蛋白与棕色固氮菌的钼铁蛋白的交叉互补作用

纯化的柱孢鱼腥藻铁蛋白能够与棕色固氮菌的钼铁蛋白有效地交叉反应,展现较高的活性。此异源交叉反应的乙炔还原比活及放氢比活,分别是蓝藻同源互补比活的83.8及66．7％。比较藻铁蛋白与菌钼铁蛋白异源交叉反应及藻固氮酶组分之间的同源反应的动力学特点时发现,铁蛋白对钼铁蛋白的最佳克分子比数前者(异源交叉反应)较后者(藻同源反应)为高,前者为5,后者为1;但反应的时间进程两者差别不大。     

棕色固氮菌突变种UW3部分提纯的固氮酶CrFe蛋白溶液中残存细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定

从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白.在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现,棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现.SDS-PAGE和厌氧天然PAGE皆表明,棕色晶体主要由与固氮酶钼铁蛋白(Av1)类似大小的亚基(～60 kD)组成,而砖红色晶体则由～20kD亚基组成.免疫分析表明只有～60kD的亚基可与固氮酶钼铁蛋白的抗体反应,而～20kD亚基则无这种反应.在部分纯的CrFe蛋白溶液中,～20 kD的总蛋白含量远低于～60 kD蛋白的含量,表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白溶液中的一种污染蛋白.用3,5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明,形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白.质谱分析表明砖红色晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白.分辨率为2.34 A的X射线衍射结果也表明,砖红色晶体属于H3空间群,晶胞参数为a=124.965A,b=124.965A和c=287.406 A.即将发表的三维结构解析表明,此砖红色晶体确为24聚体的细菌铁蛋白.     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的研究(四)

应用荧光探剂——荧光醋酸汞和荧光胺研究了棕色固氮菌固氮酶的两种蛋白组分与MgATP和MgADP的关系。实验确证该菌钼铁蛋白不能与MgATP和MgADP络合,而铁蛋白则能。每分子铁蛋白络合2个分子MgATP,但至少是络合2个分子MgADP,反应的部位是在铁蛋白的巯基上。MgATP和MgADP与铁蛋白络合后,引起铁蛋白构型变化,使铁蛋白中可与荧光胺反应的氨基量增加。MgATP和MgADP二者与铁蛋白作用后所得结果相近似。在没有MgATP存在条件下,钼铁蛋白仍能与铁蛋白相互作用,并在巯基部位上产生变化。对于氨基也有影响。     

棕色固氮菌突变种UW3部分提纯的固氮酶CrFe蛋白溶液中残存细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定

从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现,棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDS-PAGE和厌氧天然PAGE皆表明,棕色晶体主要由与固氮酶钼铁蛋白(Av1)类似大小的亚基(～60kD)组成,而砖红色晶体则由～20kD亚基组成。免疫分析表明只有～60kD的亚基可与固氮酶钼铁蛋白的抗体反应,而～20kD亚基则无这种反应。在部分纯的CrFe蛋白溶液中,～20 kD的总蛋白含量远低于～60 kD蛋白的含量,表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白溶液中的一种污染蛋白。用3,5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明,形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白。质谱分析表明砖红色晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白。分辨率为2.34的X射线衍射结果也表明,砖红色晶体属于H3空间群,晶胞参数为a=124.965,b=124.965和c=287.406。即将发表的三维结构解析表明,此砖红色晶体确为24聚体的细菌铁蛋白。     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因人工合成及其原核表达

根据GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)、拖丝蛋白基因的结构特点和密码子的简并性,设计378 bp的拖丝蛋白基因单体,并对其人工聚合成二聚体.Primer5.0分析结果表明,决定拖丝弹性和抗拉力的氨基酸(Gla和Ala)含量(41.43和18.22)接近天然丝蛋白氨基酸含量(42.81和26.32);利用Antheprot软件对二聚体编码氨基酸的二级结构预测结果显示,与丝蛋白的氨基酸链相近,由2个相同的部分排列而成,即β-片层(占48%)、6个α-螺旋间隔(占15%)、散在的转角(占12%)和若干不规则卷曲(占25%).将二聚体与pET-28a( + )连接构建原核表达载体,IPTG诱导重组菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为26.6×103 kD的重组蛋白.上述结果为进一步开展有关转蜘蛛拖丝蛋白基因在绵羊被毛中表达的研究奠定了基础.     

铁钼辅因子

某些固氮生物(如棕色固氮菌)的变种,它们的固氮酶中铁蛋白有催化活性,但由于钼铁蛋白处于不活化状态,所以整个固氮酶不能显示出固氮活性,这种不能固氮的固氮酶可为从野生型固氮菌固氮酶钼铁蛋白中分离得到的物质(或因子)所活化或恢复固氮活性,此种活化因子叫钼铁辅因子。这种钼铁辅因子已从多种固氮生物中分离到,其分子量为1000～3000左右。按钼铁蛋白分子量为270,000计算,其中铝、铁、硫三种原     

钼,铁,硫化合物激活曝氧的棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的研究

曝氧后,棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白的催化活性和圆二色信号都显著降低,而吸收光谱则显著增加。与钼、铁、硫化合物和二硫苏糖醇组成的重组溶液保温后,曝氢蛋白的圆二色信号和吸收光谱几乎完全恢复至天然状态的同时,乙炔还原活性也得到了显著的恢复,表明重组溶液可使曝氧蛋白中的 P-cluster和其它活性部位都得到了不同程度的修复。     

腺苷酸化合物与固氮酶组分结合的化学模拟

固氮酶是由钼铁蛋白和铁蛋白组成的复合物,它们的活性中心分别由钼铁硫原子簇和Fe_4S_4原子簇所组成。MgATP除了与铁蛋白结合外,是否还能与钼铁蛋白结合,长期以来由于存在着相互矛盾的实验结果,而未能定论。