壳聚糖携载质粒纳米微球体外转染兔关节软骨细胞的实验研究

目的:研究携载质粒的不同分子量的壳聚糖纳米微球的包裹率和保护DNA的能力,镜下观察其大小和形态,观察其对原代兔关节软骨细胞的转染效率。方法:利用酶消化法消化3周龄新西兰大白兔的关节软骨,贴壁培养原代兔关节软骨细胞。购买相对分子量在5K和800K之间的八种壳聚糖,利用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒(pEGFP)作报告基因,通过复合凝聚法制备壳聚糖-质粒纳米微球。琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计分析不同N/P比值对不同分子量壳聚糖和质粒的结合能力及包封率的影响;纳米粒度仪、透射电子显微镜和环境扫描电子显微镜考察纳米微球的粒径分布和形态;荧光显微镜观察壳聚糖纳米微球介导pEGFP在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达情况;流失细胞仪计算具体转染效率。结果:①N/P值为4及4以上时,各分子量的壳聚糖可完全包裹质粒成球;N/P值为2时,分子量为5K、50K、85K仅部分包裹质粒,其余可完全包裹;N/P值为1时,各壳聚糖均与质粒部分包裹;N/P值为0.25时,各壳聚糖均与质粒完全分离。②纳米粒度仪分析得出:N/P值为4时,各分子量的壳聚糖纳米微球的平均粒径均在1微米以下,③透射电子显微镜和扫描电子显微镜均可观察到球形或不规则形的大小不同的微球。荧光显微镜可大致观察到绿色荧光蛋白在软骨细胞内表达的表达情况。④流式细胞仪得出具体转染效率,分子量为170K、250K和800K的壳聚糖纳米微球的转染效率均高于5K、50K和85K的壳聚糖纳米微球,其中800K的壳聚糖纳米微球与脂质体相当(差异有统计学意义,P<0.05)。结论:与脂质体相比,N/P比值为4时,相对分子量为800k的壳聚糖纳米微球可高效转染原代培养的兔软骨细胞,可以作为今后进一步体外、体内实验的首选转染载体。     

核壳结构CdS-TiO_2纳米颗粒体外光催化灭活白血病HL60细胞实验研究

本文研究了核壳结构CdS-TiO_2纳米颗粒光对HL60细胞光催化灭活作用,并初步探讨了CdS量子点增强TiO_2光催化灭活效率的作用机理。实验利用超声法制备了核壳结构CdS-TiO_2纳米颗粒,使用CCK-8法检测了其对白血病HL60细胞的光催化灭活效果,并采用活性氧分析和荧光发光光谱等分析手段对CdS量子点增强TiO_2光催化灭活效率的作用机理进行了分析。细胞实验结果表明,在暗室条件下,随着CdS包裹的TiO_2外壳的增厚,细胞的暗室存活率从28.5%逐渐上升至80%;在可见光照下,细胞的存活率显著下降。CdS-TiO_2纳米颗粒对HL60细胞的光催化灭活率均超过60%,其中CdS-TiO_2样品0.6对HL60细胞的光催化灭活效率最高,达到95%。根据荧光光谱和活性氧含量分析的结果推测,这可能是由于核壳结构的CdS内核与TiO_2外壳之间产生了有效的电子转移,抑制了TiO_2的空穴电子的复合,增强了TiO_2外壳的光催化活性,最终增加了TiO_2对HL60细胞的PDT灭活效果。     

纳米金-聚乙烯亚胺基因载体的制备

目的:基因方法治疗癌症近年来取得了很大的突破,因此基因载体的构建显得尤为重要.其中纳米基因载体合成简单,成本低廉,并能够包裹、浓缩、保护核苷酸使其免受核酸酶降解,因此纳米材料广泛地应用于基因输送.我们拟开展聚乙烯亚胺-纳米金基因载体的制备及其表征.方法:采用层层包裹技术制备基因载体,首先通过柠檬酸钠还原法制备纳米金颗粒后,应用11-巯基十一烷酸对金颗粒进行修饰,使其表面带有羧基,然后进一步将带有氨基的低分子量聚乙烯亚胺与羧基进行连接.应用动态光散射(DLS),紫外可见光谱(UV)和透射电子显微镜(TEM)对构建的纳米基因载体进行表征.结果:成功制备了聚乙烯亚胺-纳米金基因载体,检测表明每一步制备出的产物纳米尺寸在20-30nm之间,液体均匀稳定,分散系数(PDI)在0.2以下,Zeta电位测定表明,每步的产物电荷变化与外层包裹的反应物有关.尽管金颗粒外层包裹聚乙烯亚胺,但是总体上纳米载体尺寸没有发生太大的变化,TEM检测表明每一步形成了均匀的、单分散的、球状的纳米颗粒.结论:我们通过层层包裹技术成功制备了聚乙烯亚胺-纳米金基因载体,在进一步开展的生物活性的检测中,希望通过纳米载体的携带作用,将基因转染进靶细胞,从而检测相关基因对靶细胞的沉默作用,提高基因药物的应用,为开发新型基因药物提供基础.     

壳聚糖携载质粒纳米微球体外转染兔关节软骨细胞的实验研究

目的：研究携载质粒的不同分子量的壳聚糖纳米微球的包裹率和保护DNA的能力,镜下观察其大小和形态,观察其对原代兔关节软骨细胞的转染效率。方法：利用酶消化法消化3周龄新西兰大白兔的关节软骨,贴壁培养原代兔关节软骨细胞。购买相对分子量在5K和800K之间的八种壳聚糖,利用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒（pEGFP）作报告基因,通过复合凝聚法制备壳聚糖-质粒纳米微球。琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计分析不同N/P比值对不同分子量壳聚糖和质粒的结合能力及包封率的影响;纳米粒度仪、透射电子显微镜和环境扫描电子显微镜考察纳米微球的粒径分布和形态;荧光显微镜观察壳聚糖纳米微球介导pEGFP在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达情况;流失细胞仪计算具体转染效率。结果：①N/P值为4及4以上时,各分子量的壳聚糖可完全包裹质粒成球;N/P值为2时,分子量为5K、50K、85K仅部分包裹质粒,其余可完全包裹;N/P值为1时,各壳聚糖均与质粒部分包裹;N/P值为0.25时,各壳聚糖均与质粒完全分离。②纳米粒度仪分析得出：N/P值为4时,各分子量的壳聚糖纳米微球的平均粒径均在1微米以下,③透射电子显微镜和扫描电子显微镜均可观察到球形或不规则形的大小不同的微球。荧光显微镜可大致观察到绿色荧光蛋白在软骨细胞内表达的表达情况。④流式细胞仪得出具体转染效率,分子量为170K、250K和800K的壳聚糖纳米微球的转染效率均高于5K、50K和85K的壳聚糖纳米微球,其中800K的壳聚糖纳米微球与脂质体相当（差异有统计学意义,P〈0.05）。结论：与脂质体相比,N/P比值为4时,相对分子量为800k的壳聚糖纳米微球可高效转染原代培养的兔软骨细胞,可以作为今后进一步体外、体内实验的首选转染载体。     

番茄环斑病毒纳米荧光颗粒试纸条的研制

目的:研发一种快速、便捷检测番茄环斑病毒(ToRSV)的方法。方法:以荧光纳米颗粒为标记物,采用免疫层析试验方法制备ToRSV荧光纳米颗粒试纸条,在紫外灯下观察试纸条上的荧光信号,作为结果判定依据。结果:用制备的荧光纳米颗粒试纸条检测包括ToRSV在内的9种病毒,仅ToRSV有阳性反应,其余待测样品均呈阴性,表明该试纸条具有较好的特异性;用该荧光试纸条与传统胶体金试纸条进行灵敏度测试时,其灵敏性高于胶体金试纸条1倍以上,且稳定性试验结果良好。结论:ToRSV荧光纳米颗粒试纸条的研制,为快速检测ToRSV提供了有效手段,该方法可用于现场检验,具有广阔的应用前景。     

纳米级壳寡糖/DNA复合物的制备和性能研究

同甲壳素和壳聚糖这种生物大分子相比,壳寡糖具有许多独特的功能性质,如水溶性、保湿性、抗菌性、抗肿瘤和免疫促进性等。以数均分子量为5000的壳寡糖作为研究模型,根据凝胶电泳和紫外光谱分析,提出纳米级壳寡糖与pEGFPC-1质粒能通过静电结合或物理包裹形成复合物从而对DNA进行保护,同时证明形成壳寡糖/DNA复合物后,壳寡糖能够极大地提高DNA的贮存稳定性和结构稳定性;而DNaseI酶解实验也显示纳米级壳寡糖在合适比例下DNA有良好的保护作用,使其不被DNaseI降解,证明了纳米级壳寡糖应用于基因治疗载体的可行性与安全性。     

g-C_3N_4@C-TiO_2纳米颗粒增强可见光驱动的体外光动力灭活HL60细胞的试验研究

通过化学气相沉积法制备了g-C_3N_4@C-TiO_2纳米颗粒,利用X射线衍射(XRD)、荧光光谱(FS)、透射电子显微镜(TEM)、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、能谱(EDS)等对纳米颗粒进行表征。分别研究了暗室条件及光照条件下g-C_3N_4@C-TiO_2纳米颗粒对HL60细胞的作用效果。采用CCK-8法探究了一系列质量浓度梯度的纳米颗粒处理HL60细胞后的存活率,并且通过荧光探针标记技术检测细胞内活性氧水平。试验结果表明,在C-TiO_2表面包裹g-C_3N_4,可将TiO_2可吸收的光波长范围拓展至可见光波段。制备的g-C_3N_4@C-TiO_2粒径在10～20 nm,满足其进入细胞的尺寸要求。暗毒性试验表明g-C_3N_4@C-TiO_2纳米颗粒在暗室条件下对细胞的毒性较小,证明了其具有良好的生物相容性。同时,与TiO_2和C-TiO_2纳米颗粒处理组相比,g-C_3N_4@C-TiO_2处理组的光动力灭活效率高达(76.5±1.9)%,表明其可能成为治疗白血病的潜在光敏剂。     

核-壳型磁性纳米微球的制备及在核酸提取中的应用

目的:改进传统的溶胶-凝胶方法而制备得表面包裹SiOZ的核-壳型磁性纳米微球,然后将表面连有链霉亲和素的磁性纳米微球应用于生物样品中核酸的分离.方法:用透射电子显微镜(TEM)、红外光谱(FTIR),X射线衍射仪(XRD)和磁强计(VSM)对得到的纳米微球进行表征,最后用电泳验证核酸.结果:表明制备得到的磁性纳米微球表面包裹Si02,粒径均匀,分散性良好,并且具有超顺磁性和较大的比饱和磁化强度.电泳结果表明磁性微球可以很好地从细胞悬液、组织、血液等样品中分离得到高质量的核酸.结论:该方法简便快速有效,其过程不需要使用任何有毒溶剂,操作简单.     

壳聚糖纳米磁性微球固定脂肪氧合酶的研究

实验采用溶胶凝胶法制备了纳米磁性Fe3O4,并用壳聚糖对颗粒2四川大学,生命科学学院,四川成都表面进行了表面修饰得到壳聚糖纳米磁性微球复合载体,再以戊二醛为交联剂将脂肪氧合酶固定在复合载体上,并测定了不同因素对游离酶和固定化酶活性的影响;实验表明,微粒在电镜观察下呈亮黑色球状,直径约为150nm,并具有良好的磁性,固定在载体上酶的含量约为7.6%,游离酶的最适温度为30℃,最适p H8.0,而固定化酶的最适温度为30℃,最适p H9.0,当H2O2浓度为12.0 g/L时,游离酶和固定化酶的活性最强;实验结果表明通过交联的方法成功将脂肪氧合酶固定在了纳米磁性四氧化三铁颗粒上,并表现出了较好的活性。     

壳聚糖-有机累托石/海藻酸钠复合纳米粒的制备

目的:以BSA作为模型药物,制备壳聚糖季铵盐-OREC复合物纳米微粒,建立一种安全有效的药物控释传递系统。方法:超声条件下,制备不同质量比的具有壳聚糖硅酸盐插层结构的复合物纳米微粒,观察其形态学特征、进行红外光谱分析。同时,测定OREC对BSA包封率和载药量的影响。结果:成功制备了不同质量比的OREC-HTCC纳米粒子。电镜结果显示纳米粒呈圆球形,均匀,平均粒径约为30nm。红外图谱分析证实,HTCC插入了OREC插层中,BSA成功地包裹入HTCC-ALG/OREC混合材料制备的纳米微粒。加入OREC后,纳米粒子的包封率及载药量均明显提高,但随着加入量的增加,包封率及载药量逐渐减少。结论:OREC-HTCC纳米粒子是良好的蛋白药物载体,具有粒径小、包封率高、缓释效果好等优点,为CS-OREC作为潜在的药物给药系统的进一步应用提供科学依据。