Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞CXCR4表达水平及向SDF-1趋化能力的影响

为研究Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞(MSCs)CXCR4表达水平及向SDF-1趋化能力影响, 将重组真核表达载体(pCAGGSneo-snail-HA)及对照空质粒(pCAGGSneo)转染MSCs, 采用免疫荧光细胞化学染色、荧光标记流式细胞仪技术及RT-PCR检测细胞CXCR4表达水平; 体外跨膜趋化实验评价MSCs向SDF-1趋化能力, 观察抗CXCR4中和抗体的干预作用。MSCs-Sna的CXCR4表达水平明显高于MSCs-neo。MSCs-Sna在SDF-1诱导下细胞迁移量较MSCs-neo显著增加(P<0.05)。抗CXCR4中和抗体可显著减少SDF-1a诱导的MSCs-Sna趋化运动。研究提示通过上调Snail表达而提高MSCs向正调节表达SDF-1的受损组织迁移效率的可行性, 为优化MSCs迁移力的研究提供了实验基础。     

3种间充质干细胞成软骨分化潜能比较

目的:比较骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞3种间充质干细胞的成软骨分化潜能,为软骨组织工程中种子细胞的选择提供实验依据。方法:采用贴壁法分别分离提取兔骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞3种间充质干细胞,并进行传代培养,绘制3种间充质干细胞的生长曲线并比较其倍增时间。将3种间充质干细胞成软骨诱导14 d后,行甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色以观测3种细胞成软骨分化能力。结果:脂肪间充质干细胞的倍增时间短于骨髓间充质干细胞,滑膜间充质干细胞的倍增时间最短;3种细胞成软骨诱导14 d后均产生糖胺聚糖和II型胶原,且组与组之间II型胶原表达水平的差异有统计学意义,骨髓间充质干细胞组高于脂肪间充质干细胞组(P0.01),滑膜间充质干细胞组高于骨髓间充质干细胞组(P0.01)。结论:在一定的培养条件下,3种间充质干细胞均有一定的成软骨细胞分化潜能,滑膜间充质干细胞最快的增殖速度及最强的成软骨分化潜能。     

DDR2基因缺失对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的:骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是骨再生工程中重要的种子细胞,它对骨组织缺损的修复有着良好的效果。但是BMSCs向成骨细胞分化并修复骨组织缺损是是由细胞外因子共同作用产生的结果。DDR2(Discoidin Domain Receptor 2)作为I型胶原的特异性受体在成骨细胞的分化中发挥重要的调节作用。而对于其在BMSCs向成骨细胞的分化过程中的所起到的作用还鲜有研究,对其作用机理尚不明确。因此我们希望通过分离、培养并鉴定比较DDR2基因缺失小鼠与野生型小鼠来源的骨髓间充质干细胞了解其生物学特性,为后续的实验奠定理论基础。方法:采用改良型的全骨髓贴壁细胞分离方法分离培养两种小鼠来源的骨髓间充质干细胞,采用流式细胞技术鉴定其表面标记物的表达,并利用诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成脂肪细胞分化。结果:分离培养的两种骨髓间充质干细胞形态一致,增殖能力和自我更新能力强,流式细胞术检测其表面标记物CD29,Sca-1均表达阳性,CD105,CD45表达为阴性,分离得到的两种细胞均有向成骨细胞和成脂肪细胞分化的能力,但可以明显观察到DDR2基因缺失小鼠的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力减弱。结论:本实验通过对于DDR2基因缺失小鼠BMSCs分离、培养和鉴定,初步探索DDR2基因缺失在在成骨过程中的作用结果,为进一步研究提高BMSCs的成骨分化能力奠定理论基础。经实验证明,DDR2基因缺失小鼠来源的骨髓间充质干细胞虽然仍具备干细胞的生物学特性,但其向成骨细胞的分化能力明显减弱,说明DDR2基因缺失对其骨髓间充质干细胞的成骨分化等有着重要的影响。     

Tie-2单克隆抗体鉴定人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化的内皮细胞

目的:体外扩增和定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向内皮细胞分化,并探讨其可行性和条件.方法:利用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离MSCs,用含10?S的LG-DMEM培养基进行纯化和扩增培养,流式细胞仪分析鉴定MSCs的纯度.用含VEGF(10μg/L)的HGDMEM培养基诱导MSCs向内皮细胞定向分化,Tie-2单克隆抗体的免疫组化法和透射电镜(TEM)鉴定其细胞的性质.结果:5.0×105个MSCs在体外扩增15代后,获得了8.0×1012个MSCs,扩增了约1.6×107倍.加入诱导培养体系培养14～21 d,光镜下可观察到内皮细胞呈典型的"鹅卵石"样:90%的细胞Tie-2免疫组化呈阳性反应;TEM下可观察到胞浆内有Weible-palade小体.结论:成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为内皮细胞的潜能,为构建心脏组织工程瓣种子细胞的来源提供了可能性.     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头无菌性坏死的临床观察

目的:观察自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头无菌性坏死的临床效果及安全性.方法:对2012年9月至2013年1月期间在我院骨科住院治疗的55例患者随机分成两组,对照组接受常规治疗,治疗组接受自体骨髓间充质干细胞移植治疗治疗.结果:治疗组的临床疗效优于对照组,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);治疗组治疗后的DSA检查结果与对照相比,差异有统计学意义(P＜0.05);两组不良反应相互比较,无统计学意义(P＞0.05).结论:自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头无菌性坏死效果显著,优于常规治疗.     

骨髓间充质干细胞捕获支架对犬冠状动脉再狭窄影响的研究

目的:观察骨髓间充质(MSCs)干细胞捕获支架能否预防和减少犬冠状动脉支架植入术后再狭窄.方法:①用乙基纤维素作为包被底物对支架进行包被,然后再包被骨髓间充质干细胞抗体.②以球囊损伤法建立犬冠状动脉狭窄模型,应用标准球囊导管技术,将包被有抗体的支架植入犬(n=20)冠状动脉前将支损伤段远端,再以相同方法在损伤段近端植入裸支架作为对照组(n=20).4w后处死动物,取出支架段血管行血管内超声(IVUS)及血管形态学检测分析血管管腔面积和内膜增生面积.结果:术后4周,骨髓间充质干细胞捕获支架组较裸支架组的最小管腔直径和新生内膜面积较明显减少(P<0.05),而最小管腔面积则明显增加(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞捕获支架能快速修复损伤的血管内膜,降低再狭窄的发生.     

Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra(Stimulated by Retinoic Acid)基因。从鼠源分离得到的Stra8基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8基因的启动子序列(1.4kb)。将Stra8基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑出血模型的实验研究

目的:研究大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)移植治疗脑出血的可行性。方法:分离MSCs后,连续传代培养、扩增,Brdu标记的MSCs通过颈动脉、侧脑室2种途径移植入脑出血大鼠模型体内,采用爬行计分法评估神经功能的恢复程度,并观察脑部Brdu阳性细胞的分布。结果:通过侧脑室、颈动脉移植后大鼠神经功能改善,明显优于对照组(P<0.05);经颈动脉注射组较经侧脑室注射组爬杆实验评分低(P<0.05)。移植的MSCs主要迁移到出血灶、大脑皮层、海马区等处。结论:MSCs移植对脑出血具有保护作用,而经颈动脉给药疗效优于经侧脑室给药。     

骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑出血模型的实验研究

目的：研究大鼠骨髓间质干细胞（Mscs）移植治疗脑出血的可行性。方法：分离MSCs后,连续传代培养、扩增,Brdu标记的MSCs通过颈动脉、侧脑室2种途径移植入脑出血大鼠模型体内,采用爬行计分法评估神经功能的恢复程度,并观察脑部Brdu阳性细胞的分布。结果：通过侧脑室、颈动脉移植后大鼠神经功能改善,明显优于对照组（P〈0．05）;经颈动脉注射组较经侧脑室注射组爬杆实验评分低（P〈0．05）。移植的MSCs主要迁移到出血灶、大脑皮层、海马区等处。结论：MSCs移植对脑出血具有保护作用,而经颈动脉给药疗效优于经侧脑室给药。     

骨髓间充质干细胞可塑性研究

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs）具有跨系统、甚至跨胚层分化的特性,称为MSCs的可塑性（plasticity）,成为细胞工程、再生医学中的主要选择细胞。但随着对成体干细胞可塑性质疑的出现,使MSCs是否具有转分化能力,存在着极大的分歧。对MSCs可塑性是否真正存在的进一步明确,越加显得急切和重要,也对干细胞基础理论及其临床应用具有指导性意义。     

小鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和Survivin的表达研究

为培养及鉴定小鼠来源骨髓间充质干细胞,并测定细胞中Survivin的表达情况,采用全骨髓培养法获取骨髓间充质干细胞,绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,行成骨、成脂检测,RT-PCR测定Survivin表达情况.结果表明培养出的细胞呈长梭状成纤维细胞样,经流式细胞仪检测细胞表面高表达CD29、CD34、CD44、SCA-1,低表达CD117;细胞曲线显示传代细胞培养1～3d生长缓慢,第4d生长加快并于第7d达到高峰;成骨诱导20d经茜素红染色呈红色结节,成脂诱导14d油红O染色显示有大量脂质沉淀;RT-PCR结果显示Survivin mRNA阳性表达.经全骨髓培养法可以培养出大量骨髓间充质干细胞,同时Survivin在小鼠骨髓间充质干细胞中正常表达,提示可能参与骨髓间充质干细胞抗凋亡过程.     

小型猪骨髓间充质干细胞的分离和培养

目的建立小型猪骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的体外分离和培养方法。方法穿刺小型猪髂后上嵴抽取骨髓,经密度梯度法离心得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞。用形态学方法鉴定培养的MSCs。结果经培养存活的MSCs原代和一代呈纺锤型、多边型或星型。至二代起呈均一纺锤型,似成纤维细胞样,长宽比例约为（2～3）？1。体外培养的原代MSCs8～10d达到融合,传代后仍具有较强的增殖能力。结论小型猪MSCs可在体外长期、稳定培养,其分离、培养体系的建立为基础研究和组织工程技术提供了一个有价值的动物模型。     

骨髓间充质干细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体 ,具有支持造血、多向分化潜能以及在细胞和基因工程中具有潜在应用前景等特点 ,将在医学上具有重要的临床应用价值。     

骨髓间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响,并对其相关机制进行探讨。方法:90只大鼠随机分为3组:假手术组、对照组、BMSC移植组,每组30只。对照组和BMSC移植组建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,假手术组只需要分离大鼠颈部组织,而不造MCAO模型。BMSC移植组在MCAO模型术后1天经尾静脉注射1 mL/3×10~6 BMSC,对照组注射同剂量的生理盐水,于MCAO术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d分别对各组大鼠进行神经功能评分(mNSS),术后2个月对BMSC移植组及对照组大鼠脑组织进行免疫组化染色,检测MAP2、TUJ1、Ⅷ因子、GFAP的表达情况。结果:在治疗后的第7天至第35天,BMSC移植组mNSS均显著低于对照组(P0.05)。术后2个月,BMSC移植组MAP2、TUJ1、Ⅷ因子表达量显著高于对照组,而GFAP表达量显著低于于BMSC对照组(P0.01)。结论:BMSC移植可以促进脑梗死神经功能的恢复。     

预血管化细胞膜片的构建

为探索新的体外获得毛细血管样网络结构来解决工程化组织预血管化的问题,该研究将人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)以9×104/cm2细胞密度体外连续培养形成细胞膜片,将培养的脐静脉血内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)以5×104/cm2细胞密度接种到上述间充质干细胞膜片上,并培养在内皮细胞培养介质中。在设计的时间点用倒置相差显微镜观察,发现内皮细胞在膜片上迁移,细胞重排,膜片上的基质蛋白也发生重排,导致微槽和空泡出现。CD31免疫荧光染色观察到进行性管腔形成的过程;CD90免疫荧光染色显示膜片上的hMSCs围绕着HUVECs周边排列,说明hMSCs作为周细胞支持了HUVECs的生长;在培养第10 d可见少量的α-SMA的表达,暗示着在此种培养模式下,hMSCs具有较低的向肌细胞分化的潜能。这些结果表明,将内皮细胞接种在未分化干细胞膜片上,可以在体外形成具有血管网络结构的预血管化膜片,为构建血管化工程化组织提供了新的思路。     

骨髓间充质干细胞全细胞抗原干预移植瘤生长的实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem cells,MSCs)的全细胞抗原(WCAs)对于人肺腺癌细胞株A549移植瘤的预防接种作用,为发掘肿瘤免疫治疗提供新策略。方法:采用全骨髓贴壁法原代培养小鼠MSCs并以流式细胞仪鉴定,取3~5代MSCs细胞以15Gy X线灭活获取(Whole cell antigens,WCAs),以该抗原皮下接种于BALB/c小鼠(1次/3 d,共2周),获得免疫接种小鼠模型,对照组皮下注射同体积的PBS;为了方便示踪,以Lipofectamine TM 2000细胞脂质体转染绿色荧光蛋白(GFP),获得标记GFP-A549细胞株,皮下移植瘤株进行荷瘤,采用小动物荧光成像仪观察肿瘤生长;同时评估肿瘤直径并计算肿瘤体积,行Ki-67免疫组化染色初步分析肿瘤增殖能力。结果:肺腺癌GFP-A549细胞株皮下移植成功使小鼠荷瘤,实验组小鼠的肿瘤体积显著小于对照组(P0.05,P0.01),小动物荧光成像仪结果与解剖结果一致;实验组Ki-67的表达低于对照组。结论:本研究采用MSCs获得WCAs在荷瘤前对小鼠进行免疫刺激,发现其确实有抑制肿瘤生长的作用。     

骨髓间充质干细胞治疗脑梗死

目的:研究骨髓间充质干细胞(MSC)对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗机制。方法:20只Wistar大鼠随机分为对照组和MSC治疗组。应用GFP阳性MSC,再灌注1d后经尾静脉注射MSC(1×106),对照组则注射PBS。采用线栓法建立脑缺血再灌注模型。术后每天由双盲于试验组的研究人员应用爬杆计分法评定大鼠神经功能。缺血2h再灌注8d取脑组织,用免疫组织化学方法检测脑组织中bFGF的表达。结果:MSC治疗组大鼠的神经功能缺损评分明显低于手术组和对照组(P<0.05)。MSC治疗组缺血侧缺血周边区脑组织中观察到GFP阳性与bFGF免疫组化染色阳性细胞。结论:经尾静脉给予的MSC可促进脑缺血再灌注大鼠的运动功能恢复;bFGF表达升高,可能是MSC脑保护作用机制之一。     

预血管化细胞膜片的构建

为探索新的体外获得毛细血管样网络结构来解决工程化组织预血管化的问题,该研究将人骨髓间充质干细胞（humanmesenchymalstemcells,hMSCs）以9×10^4／cm。细胞密度体外连续培养形成细胞膜片,将培养的脐静脉血内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs）v25x104／cm2细胞密度接种到上述间充质干细胞膜片上,并培养在内皮细胞培养介质中。在设计的时间点用倒置相差显微镜观察,发现内皮细胞在膜片上迁移,细胞重排,膜片上的基质蛋白也发生重排．导致微槽和空泡出现。CD31免疫荧光染色观察到进行性管腔形成的过程;CD90免疫荧光染色显示膜片上的hMSCs围绕着HUVECs周边排列,说明hMSCs作为周细胞支持了HUVECs的生长;在培养第10d可见少量的α-SMA的表达,暗示着在此种培养模式下,hMSCs具有较低的向肌细胞分化的潜能。这些结果表明,将内皮细胞接种在未分化干细胞膜片上,可以在体外形成具有血管网络结构的预血管化膜片,为构建血管化工程化组织提供了新的思路。     

HIF-2α诱导MSCs向内皮细胞分化的机制

缺氧诱导因子-2（hypoxia—inducible factor-2,HIF-2）是一种转录因子。其主要活性作用部位是HIF-2α亚基,与HIF-10L有高度同源性,但二者在基因调节中有不同的作用,HIF-2α能优先表达某些靶基因如EPO、IGF、VEGFR等,是近年来研究较热门的一种促血管新生因子。骨髓间充质干细胞（mesenchy—real stem cells,MSCs）向内皮细胞分化、促进血管新生及管腔形成在很大程度上取决于HIF-2α的调节作用,此调节过程主要依赖于VEGF／VEGFR信号途径。     

骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的研究进展

肝纤维化及其终末病变肝硬化已严重危害全球人类健康,虽然慢性肝病的治疗手段和抗肝纤维化药物的研究已取得了很大进展,肝移植依然是最有效的治疗方案,但器官的紧缺却是一个现实问题。目前寻找有效的干预手段进行抗肝纤维化治疗已越来越受到大家的关注。近些年,大量基础及临床研究均证实在一定条件下利用骨髓间充质干细胞(MSCs)可以抑制肝星状细胞活化诱导其凋亡,实现肝纤维化逆转。随着干细胞技术的快速发展,基于骨髓间充质干细胞(MSCs)的细胞疗法在肝纤维化治疗领域的研究与应用已成为一个充满生命力的新方向。本文将对肝纤维化及基于MSCs的治疗机制进展及其应用进行综述。