重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。     

人生长激素基因的cDNA克隆,原核高效表达及纯化

用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从含有全长人生长激素（ＨＧＨ）基因的ＣＨＯ细胞中获得ｈｇｈ的ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＥＴ－１１ｂ载体中,在大肠杆菌中获得高效表达,表达量占菌体蛋白总量的２０％。经色谱纯化后,纯度大于９５％。     

重组人ERP57蛋白克隆和原核表达

目的：克隆人ERP57蛋白进行原核表达和纯化。方法：采用巢式RT-PCR从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人ERP57 cDNA,构建ERP57原核表达质粒（pET-28a/ERP57）并转化E.coli的BL21菌株。IPTG诱导蛋白表达,并在变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化。分别用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果：成功获得大小为1518bp的人ERP57基因片段,转化菌诱导性表达61kDa的人ERP57蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功获得纯化的重组人ERP57蛋白,为后续ERP57蛋白功能研究奠定了基础。     

人源抗菌肽LL-37的原核表达及活性鉴定

目的:实现大肠杆菌高效可溶表达人源抗菌肽LL-37。方法:LL-37基因克隆至原核载体pET32a,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。运用相关生物信息学软件分析重组蛋白Trx-LL-37的理化性质、亲/疏水性、蛋白质二级结构及其可溶表达概率。实验还考察了不同诱导温度对重组蛋白可溶表达比例的影响。结果:生物信息学分析显示,Trx-LL-37分子量21.5kD,理论等电点6.3,物理性质稳定,二级结构简单,具有可溶表达倾向。重组蛋白最佳诱导温度为17℃,与37℃相比,可溶表达比例由37.2%提高至50.2%,并且总表达量也提高了5%左右。抑菌结果显示纯化产物对多种常见细菌的生长具有抑制作用。结论:可采用融合方式通过原核系统高效可溶表达LL-37,为LL-37的功能研究打下基础。     

人角质细胞生长因子2在不同原核表达系统中的表达差异

目的:比较重组人角质细胞生长因子2(rhKGF-2)在不同原核表达系统中的表达量和表达稳定性之间的差异。方法:利用PCR方法从人胚胎肺成纤维细胞cDNA扩增得到hKGF-2序列,双酶切后分别克隆到pBV220、pQE31和pET-24b载体中,分别转化大肠杆菌JM109、M15和BL21(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE分析rhKGF-2的表达量和表达稳定性,并纯化rhKGF-2。结果:pBV220-rhKGF-2与pET-24b-rhKGF-2在宿主菌内经诱导后均有目的蛋白表达,其中pBV220-rhKGF-2的表达量约占菌体总蛋白的10%,pET-24b-rhKGF-2的表达量约占菌体总蛋白的25%,且均为可溶性表达,但后者的表达稳定性明显优于前者,而pQE31-rhKGF-2在宿主菌内几乎没有表达。结论:hKGF-2在不同原核表达系统中的表达量和表达稳定性存在明显差异。     

重组人源过氧化氢酶表达优化和纯化研究

研究了重组表达人源过氧化氢酶酵母菌株G13的发酵工艺和纯化方法.对接种量、生长期培养基、生长时间、诱导时间等因素进行了优化,并确立了10 L发酵罐的发酵条件.结果表明,菌体最高密度达到了0.15 g/mL,比原重组菌株S4提高了1倍,人源过氧化氢酶表达量也由原来的平均600 U/mL提高到了1500 U/mL.同时建立...     

重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测

目的:在大肠杆菌中表达半乳凝集素-1(galectin-1),并进行纯化及生物活性检测。方法:将人半乳凝集素-1基因克隆至带有His融合标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western印迹鉴定,并用红细胞凝集试验检测其生物学活性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定表明重组表达质粒pQE-30-Galectin-1构建正确;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,且具有良好的红细胞凝集活性。结论:在大肠杆菌中表达了重组人半乳凝集素-1,且具有良好的生物活性。     

人Neuritin在原核表达系统的构建及表达纯化

Neuritin是一种新发现能促进神经突起和轴突分支的蛋白,为了更清楚的研究它的生物学功能,我们在已克隆Neuritin cDNA的基础上, PCR扩增出Neuritin ORF,与原核表达载体pET32a重组后,成功的构建了Neuritin原核表达质粒pET32a-Neuritin。重组质粒转化BL21大肠杆菌, IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE 和Western blot证实系Neuritin,用镍离子亲和层析的方法获得了纯化的Neuritin蛋白。     

重组人卵泡刺激素在昆虫细胞中的表达

为了研究在昆虫细胞中表达重组人卵泡刺激素,我们以人胎盘组织提取的染色体DNA为模板,利用重叠PCR方法扩增出hFSHβ亚基的cDNA的编码区。将此cDNA克隆入核型多角体病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表达载体pVLl393,我们得到了表达载体pVLl393-hFSHβ,然后与BaculoGold^TM线性杆状病毒DNA共转染昆虫细胞SF9,经多次扩增后获得高滴度的重组病毒AcNPV-hFSHβ。将此重组病毒感染昆虫细胞,我们得到了在胞浆中表达的hFSHβ亚基,Western blot显示分子量大约为21kDa。以重组病毒AcNPV-hFSHβ与AcNPV-hCGoL一同感染昆虫细胞得到了具有分泌性的重组hFSH异二聚体,在非还原的条件下Western blot显示分子量大约为33kDa。     

重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究

采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V<,1>变异型全长序列和V<,2>变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段.并克隆入pET30a<'(+)>载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%.表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白.将融合蛋白免疫小...     

重组hKGF2原核表达载体的构建及其蛋白质的纯化

角质细胞生长因子2（ keratinocyte growth factor 2, KGF2）是新近发现且发展迅速的成纤维细胞生长因子家族中新的一员,又称FGF10,是上皮细胞特异性的促有丝分裂剂,应用前景广泛。为构建其高效原核表达菌株,首先用RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞中获得去除信号肽的hKGF2 cDNA,将其插入pMD18-T载体;经测序后,克隆入pET-30a( + )表达载体,将成功构建的pET-30a( + )- hKGF2重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE及Western blot鉴定重组蛋白为高效可溶性表达。重组蛋白经Ni+-NTA（镍亲和层析）一步法纯化后纯度达95%以上,为进一步的应用研究及大规模生产奠定了基础。     

犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定

以伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的犬外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pBV220并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的犬α干扰素基因同源性为100%.将重组表达载体转入宿主菌进行温敏诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,证明目的蛋白以包涵体的形式存在,大小约为19kDa.将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入犬肾细胞上,用水泡性口炎病毒攻毒,测出重组的CaIFN-α具有较高的抗病毒作用,生物活性达到5.11×10 6∪/㎎,重组蛋白质的含量约为13㎎/L.     

Expression and immunoreactivity of a human group a rotavirus Vp4

Rotavirus capsid protein Vp4 plays an important role in the virus adhering and entering the cells. In this study, a Vp4 gene cloned from a rotavirus strain TB-Chen was highly expressed in E. coli BL21 (DE3). The results of the Western blot showed that the protein possesses specific immuno-reactivities and can be specifically recognized by guinea pig antibodies against rotavirus strain SA11 or Wa. Some Vp4 dimers were formed during renaturation. These data obtained from this study provide a strong basis for further study on the structure and function of the Vp4.      

犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定

以伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的犬外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,通过RT PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pBV220 并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的犬α干扰素基因同源性为100%。将重组表达载体转入宿主菌进行温敏诱导表达,表达产物经SDS PAGE分析,证明目的蛋白以包涵体的形式存在,大小约为19kDa。将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入犬肾细胞上,用水泡性口炎病毒攻毒,测出重组的CaIFN α具有较高的抗病毒作用,生物活性达到5.11×106 ∪/ ,重组蛋白质的含量约为13 /L。     

Expression and Immunoreactivity of a Human Group A Rotavirus Vp4

Rotavirus capsid protein Vp4 plays an important role in the virus adhering and entering the cells. In this study, a Vp4 gene cloned from a rotavirus strain TB-Chen was highly expressed in E.coli BL21 (DE3). The results of the Western blot showed that the protein possesses specific immuno-reactivities and can be specifically recognized by guinea pig antibodies against rotavirus strain SA11 or Wa. Some Vp4 dimers were formed during renaturation. These data obtained from this study provide a strong basis for further study on the structure and function of the Vp4.     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

艰难梭菌毒素A原核表达及重组蛋白纯化

目的 构建艰难梭菌（Clostridium difficile,C. difficile）毒素A羧基末端原核表达载体,优化诱导表达条件及纯化重组蛋白。方法 利用聚合酶链式反应扩增C. difficile毒素A羧基末端基因序列,并将此序列转入pET-28b载体,构建pET-28b-tcdA重组表达载体,并将表达载体转化到BL21（DE3）感受态大肠埃希菌细胞中,分别在不同条件下进行诱导表达,获得最佳诱导表达条件后进行大量表达,最后用Ni柱对重组蛋白进行亲和纯化,得到纯化后的重组蛋白。结果 成功构建了pET-28b-tcdA重组表达载体,其重组蛋白表达最佳诱导条件为：菌液吸光度值取0.6、温度取25 ℃、IPTG终浓度取1.0 mmol/L、诱导时间取10 h。蛋白纯化咪唑磷酸盐洗脱液最佳浓度取200 mmol/L。结论 成功构建pET-28b-tcdA重组表达载体,在大肠埃希菌BL21（DE3）中可以有效表达,并获得高浓度重组蛋白,为进一步制备TcdA适配子奠定了一定实验室基础。     

Synchronous division induced in Escherichia coli K12 by gemts mutants of phage Mu

Summary Infection with the bacteriophage mutant Mu c ⁺ gemts2 at 42° C induces synchrony in cell division in cultures of Escherichia coli K12. This synchrony may last for several cycles and is not only due to selection since synchronization is observed even when bacterial survival to the infection is over 80% as in lysogens for Mu c ⁺ gemts2. The mechanism by which sycnhrony is induced is not known, but since the product of Mu gene gem (previously called lig) has been shown to interact with the enzymatic system in the bacteria controlling the degree of DNA supercoiling, the phenomenon could be a consequence of this interaction.