放线菌种间原生质体电融合育种

以龟裂链霉菌(S．Rimosus,Otc^r,Sm ^s)和灰色链霉菌(S．Griseus,Sm^r,Otc^s)为原始出发菌株,经NTG诱变处理,获得前者(Asp^-)和后者(cys^-)营养缺陷型突变株,制成10⁹个／m1等量原生质体混合液,在岛津细胞融合装置SSH—C¹¹融合槽(电极间距为0．5mm)内,以频率lMHz、强度800V／cm的高频交流电场作电介质,电泳15s形成原生质体珠串,旋即施加电场强度6 kV／cm、短时程20μs的直流高压方形电脉冲触发原生质体融合,在R₃再生培养基上选取34971个菌落,移植于双抗基本培养基,检出四个双抗原养型融合子。它们具有亲株的优良生物学特性,生长速度较快,产素能力大,抗菌活性高。生物显影结果表明,它还产生两个亲株所不具有的抗菌活性物质。     

有淀粉糖化酶活性的耐高温酿酒酵母的构建研究

通过诱导Hu—TY一1(耐高温酿酒酵母)产孢及单孢分离得到的单倍体株Hu—TY—l—A(Sa-ccharamyces cerevisiae)与具有STAl、STA2、STA3(淀粉糖化酶)遗传因子的酵母(S．Dias-taticus)单倍体和纯合二倍体进行相同交配型的种间原生质体融合,融合率为3．3×1O^-6-8．7×1O^-6。融合子的细胞形态、大小、DNA含量、生长和发酵特性等方面均不同于亲株。融合株BA-2、BA-3、CA-18、DA-2、CCA-30、其细胞体积与DNA含量为亲株之和,30℃生长速率与生物量为亲株的2—3倍,40℃生长速率与生物量为亲株HU－TY－1－A的1．3－1．6倍,能够利用淀粉,并且在40℃高温葡萄糖发酵酒精产率比糖化酵母高,比HU－TY－1－A低,是一些有淀粉糖化酶、耐高温的酿酒酵母新菌株。     

原生质体融合技术构建糖化型啤酒酵母的研究

融合亲株B_6-5（Ala^-,Cys^-α）和T_3-4（His,Thr^-α）细胞于35％PEG（6000）－50mmol／LCaCl₂溶液,28℃下诱导融合30min,筛选出融合株,融合频率为6．2×10^-5。融合株细胞的体积和DNA含量均为两系株细胞之和。融合株有水解淀粉的能力,又有发酵度高于生产用酵母的特点。     

吸水链霉菌应城变种和庆丰链霉菌种间原生质体融合及其融合子的生物学特性

本文报道利用抗生素产生菌吸水链霉菌应城变种Leu^-Sm^R。90-11菌株(Leu’smr)和庆丰链霉菌A_553-1菌株(Pro^-Sm^R)为亲株,以42％的PEG4000为助融剂,进行了种问原生质体融合,用间接法检出融合重组子38株,其重组频率约为4．5×10^-4。重组子除孢子丝形态外,孢子堆颜色、抗药性、抗菌活性和抗生素生物合成能力方面与亲株均有一定差别,而且不同重组子之间也不相同,特别在抗菌活性方面,其中重组子FL-42和FL-48不仅具有两个亲株所产生的4种抗生素的活性,而且还产生两个亲株不具有的活性物质。通过纸层析谱表明,这种活性物质,两个重组子之间也不相同。     

原生质体融合构建耐温酵母菌株#

耐温的克鲁维酵母(Y₀₃₄)与产酒率高的酿酒酵母(A₀₀₁。)进行属间原生质体融合构建耐温酵母菌株,经DTT分段预处理获得大量具再生活性原生质体对融合株AY₀₂₃等进行了乙醇脱氢酶同工酶,麦芽糖同化,遗传稳定性及高温发酵分析,融合株AY₀₂₃表达了双亲遗传特性。在45℃高温发酵条件,乙醇产率高达7.4％,是目前已见文献报道的产酒率最高的耐温(45℃)酵母菌株。     

棒曲霉22产木聚糖酶的研究

从105株霉菌和酵母菌中筛选到一株木聚糖酶活力较高的棒曲霉(Aspergillua clavatus)菌株22。该菌株适宜的产酶培养基为(g/1):蔗渣半纤维素30,NH₄NO₃ 5,酵母膏5,麸皮10,吐温801和少量无机盐,初始pH5.5。最适的孢子接种量为4.9×10⁶个/ml。在上述培养基中28℃振荡培养72h.木聚糖酶活力可达335.9u/ml。酶反应的最适温度为50℃;最适pH为4.8,在pH 6-11酶活性稳定。     

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyueromyces lactis Y12—1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种问融合的研究。通过试验．原生质体形成及再生的最佳条件为：对数期的细胞,2％的蜗牛酶．30℃酶解30分钟．原生质体形成率90％以上,再生率20%左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-l不能旋酵菊糖;K.fragilis 8554不能同化D－松三糖和麦芽糖;利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D－松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别．在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14一l6％;连续15次传代,融合子稳定。     

链霉素生产菌—灰色链霉菌和热灰紫链霉菌的原生质体融合的研究

本文采用原生质体融合技术,把链霉素生产菌——灰色链霉菌No．45 Streptomyces griseus No.45(Lin,Rif‘)同耐高温的不产生抗生素的热灰紫链霉菌T272 Strep-griseus thermogriseoviolaceus T272(Lin^s,Rif^f)进行了原生质体融合。以抗性为选择标记,以PEG6000为助融剂,选出了融合体。制备超薄切片后在电镜下观察了原生质体融合的详细过程。在链霉素生物合成受抑制的高温(37℃)下,测定了融合体的抑菌括性,从形态上与两亲株不同的46株融合体中发现6．3％的融合体既有耐高温的特性也有抑菌的活性。     

酿酒酵母与糖化酵母的种间原生质体融合及其融合子的鉴定

本文报道了酒精生产菌株K氏酿酒酵母Sacchormyces cerevisiae var.ellipsoideus的HUK-1(his-,二倍体,但在我们所试的5种产孢培养基上均不产孢)与糖化酵母Sac—charomyces diastaticus 7c(arg-,a)的种间原生质体融合,其营养标记互补的融合频率约是2．07×10^-6—3．40×10^-5。这些融合子曾在选择培养基MMs或Mmo上连续传代10次,以促进两亲核的融合。融合子的酒精发酵特性,细胞形态、体积大小、DNA含量、繁殖速率、发酵强度以及产孢能力等方面的观察和测定结果表明,均不同于双亲菌株。用显微操作器解剖了个别原养型融台子HU—KDF—185的4孢子子囊,在获得的93个单孢株中,其淀粉发酵特性和遗传标记均有双亲类型的分离或重组现象。上述实验结果充分证明了不同倍性的酵母之间可以通过原生质体融合获得种间杂种。     

碳酸钙促进丙酮酸发酵过程中α-酮戊二酸的形成

在多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母CCTCC M202019发酵生产丙酮酸的摇瓶和发酵罐实验中发现,CaCO₃的添加对发酵液中α-酮戊二酸（α-KG）的积累有重要影响。在维生素浓度不变且供氧充分的前提下,延迟CaCO₃添加时间可明显抑制α-KG的产生,并提高丙酮酸与α-KG的碳摩尔比(C_PYR/C_αKG);而增加培养基中的CaCO₃浓度会导致αKG积累的增加。用不同物质调节发酵液中pH的实验证实：在丙酮酸发酵过程中, Ca²⁺对αKG的积累起主要作用,CO₃^2-起辅助作用,两者对α-KG的积累具有协同效应。维持培养基中CaCO₃浓度不变,改变培养基中硫胺素的浓度,对αKG的积累,特别是对C_PYR/C_α-KG值没有影响;而增加培养基中生物素的浓度,则导致αKG的浓度不断上升且C_PYR/C_α-KG值不断下降。当有Ca2+存在时,胞内丙酮酸羧化酶的活性最高可提高40%,而丙酮酸脱氢酶系的活性没有明显变化。结果表明,丙酮酸发酵过程中α-KG的形成是由于CaCO₃促进了丙酮酸羧化反应,其中Ca²⁺可显著提高丙酮酸羧化酶的活性,而CO₃^2-则有可能作为丙酮酸羧化反应的底物。