苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B对亚洲玉米螟Ofh细胞的增殖抑制和致坏死作用

【目的】研究从苦瓜Momordica charantia叶乙醇提取物中分离出的苦瓜素Ⅰ和新化合物苦瓜苷B对亚洲玉米螟Ostrinina furnacalis幼虫血细胞(Ofh)的毒力作用,并探讨其作用机理。【方法】用CCK-8法比较了苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ、苦瓜苷B和印楝素A对Ofh细胞的增殖抑制作用;用倒置相差显微镜和荧光倒置显微镜观察了苦瓜素Ⅰ及苦瓜苷B对Ofh细胞形态结构的影响,并用台盼蓝染色法和流式细胞术研究了其对Ofh细胞的致坏死作用。【结果】苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜苷B对Ofh细胞有明显的增殖抑制作用,36 h后的IC50值分别为7.566,24.340及8.514μg/m L,苦瓜素Ⅰ及苦瓜苷B对Ofh细胞的增殖抑制作用明显强于苦瓜素Ⅱ及对照药物印楝素A。苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B处理后的Ofh细胞表现为体积膨大、表面变得粗糙并有明显的空泡现象,严重破坏了Ofh细胞的形态结构。进一步的研究结果表明,8μg/m L的苦瓜素Ⅰ及苦瓜苷B处理Ofh细胞12~48 h,细胞死亡率均高于对照组,呈一定的时间依赖关系,说明苦瓜素Ⅰ对Ofh细胞的急性毒力高于苦瓜苷B。Ofh细胞经AO/EB染色后,用荧光显微观察发现,苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B处理组细胞膜破裂,细胞核受损严重,细胞呈不均匀桔黄色-橙红色荧光,呈典型的坏死特征。流式细胞仪检测结果表明,苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B对Ofh细胞具有明显的致坏死作用。8μg/m L苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B处理Ofh细胞36 h后,总坏死率分别为74.92%±2.02%和49.77%±1.69%。【结论】苦瓜素Ⅰ和新化合物苦瓜苷B对Ofh细胞均具有有效的增殖抑制和致坏死作用,这可能是苦瓜素类化合物对亚洲玉米螟的拒食作用及抑制其生长发育和生殖力的主要机制之一。     

绿僵菌素A和B对斜纹夜蛾SL-1细胞的增殖抑制和致凋亡作用

绿僵菌素A和B是生物活性分子,本研究用MTT法、相差显微观察、荧光倒置显微观察和流式细胞术比较了绿僵菌素A和B对斜纹夜蛾Spodoptera litura SL-1细胞的毒杀作用。结果表明：绿僵菌素A和B对SL-1细胞均具有明显的增殖抑制作用,且具有正比的时间-浓度-效应关系,绿僵菌素A和B处理细胞48 h后的IC50值分别为7.80和20.73 μg/mL。倒置相差显微观察发现,绿僵菌素A和B可以引起SL-1细胞变圆、胞膜收缩、有凋亡小颗粒形成。随着时间的延长,细胞悬浮致死并出现大量空泡和胞质外泄现象。但是在同样的处理浓度下,绿僵菌素A的作用较绿僵菌素B明显。用AO/EB染色后,荧光显微观察发现：绿僵菌素A 诱导的细胞荧光强度高于绿僵菌素B。流式细胞仪检测结果表明：绿僵菌素A和B对SL-1细胞具有明显的致凋亡作用。10 μg/mL绿僵菌素A和B作用细胞48 h后,SL-1细胞的总凋亡率分别达78.88%±0.97%和72.23%±2.29%。本研究从细胞水平肯定了绿僵菌素具有良好的增殖抑制和致凋亡作用,并且为它在害虫防治中的潜在应用提供了一些理论支持。     

绿僵菌素A对家蚕cecropin B和gloverin 4基因表达的影响

绿僵菌素A(DA)是由金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩羧肽类次生化合物,具有抗昆虫免疫作用,但是人们对其影响免疫相关基因调控的机理缺乏了解。本实验以家蚕Bm12细胞为材料,采用RNAi技术沉默相关转录因子,结合荧光定量PCR(q PCR)技术,明确DA处理或沉默TOLL和IMD信号通路相关转录因子后抗菌肽cecropin B和gloverin 4基因表达的变化。实验发现,DA能引起抗菌肽cecropin B基因表达上调和gloverin 4基因表达下调。利用特异性siRNA分别沉默转录因子BmRelish1、BmRelish2、BmRel、Bm FOXg1后,发现只有沉默转录因子BmRelish时,cecropin B和gloverin 4基因表达才下调,说明这两种抗菌肽的合成均通过IMD信号通路调控。当沉默BmRelish1或BmRel基因及DA处理联合作用时,cecropin B基因显著下调,说明在抑制cecropin B合成时,DA与转录因子BmRelish1或者BmRel之间存在密切的协同效应;同样,在促进gloverin 4合成时,DA与转录因子BmRelish2之间也存在着协同效应。     

印楝素对中华稻蝗血细胞的毒性影响

【目的】近年来,农药的长期使用使害虫产生抗性,同时造成了环境污染,目前多数研究侧重于化学农药对昆虫酶活性的影响,而植物源农药对昆虫的免疫毒理研究较少。【方法】通过给中华稻蝗Oxya chinensis(Thunberg)注射不同浓度的印楝素,用Wright-Giemsa染液染色和光学显微镜观察感染后血细胞的形态,对各种类型细胞进行数量统计;酶联免疫测定SOD,POD,PO,AchE,P450氧化酶和CES的活性变化。【结果】实验组血细胞发生固缩、空泡、脱粒和细胞变形等现象;与空白对照组相比,感染后不同时间段浆血胞的数量先升高后降低,粒血胞的数量先降低后升高,感染后期囊血胞数量显著增加;与溶剂组相比,60μg/L和120μg/L的SOD活性被极显著(P0.01)激活;60μg/L和120μg/L的POD活性在注射后6-24 h间被显著(P0.05)激活;120μg/L的PO活性在6-24 h被极显著(P0.01)激活;实验组中AchE活性均在10-24 h被极显著(P0.01)激活;30μg/L的CES活性被极显著(P0.01)激活;P450活性均被激活,但激活效果不明显。【结论】研究表明:植物源农药使稻蝗血细胞的形态和数量发生显著变化,血细胞中相关酶活性的变化情况可推测出稻蝗对印楝素的毒害产生免疫反应,进一步探讨了稻蝗的免疫机理。本研究不仅为稻蝗的预防和治理提供了理论依据,也为昆虫的免疫毒理学提供了参考。     

Bax通道在斑蝥素诱导草地贪夜蛾Sf9细胞凋亡中的作用

【目的】为明确Bax通道在斑蝥素诱导鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中的作用。【方法】本文利用Bax通道抑制法测定了斑蝥素诱导鳞翅目昆虫草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)细胞系Sf9细胞凋亡过程中线粒体膜电位、线粒体琥珀酸脱氢酶活性及细胞形态等方面的影响。【结果】Bax通道被抑制后,斑蝥素诱导造成的Sf9细胞线粒体膜电位的降低时间延迟,细胞形变率下降,但琥珀酸脱氢酶活性的下降未受影响。【结论】Bax通道参与了斑蝥素引起的Sf9细胞线粒体膜电位改变和细胞形态变化,而与抑制线粒体有关能量代谢的酶无直接关系。     

对硫磷处理下果蝇细胞应激基因的高通量分析

【目的】通过对硫磷处理黑腹果蝇Drosophila melanogaster(William)的S2细胞,研究果蝇细胞在有机磷杀虫剂作用下应激基因的表达及其表达量的变化。为进一步分析昆虫应激反应及分子毒理提供研究依据。【方法】利用CCK-8试剂盒和细胞计数板检测不同浓度对硫磷处理下细胞的毒性及细胞存活率,应用基因表达谱(RNA-Seq)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测用药处理后细胞内基因的差异表达及表达量的变化。【结果】在35μg/m L对硫磷浓度处理下细胞活力与其他浓度相比呈现一定程度的增强,选用35μg/m L对硫磷处理的细胞做高通量基因表达谱分析显示:35μg/m L对硫磷处理细胞后扩增表达的基因有481个,差异显著表达的基因有52个,包括氧化应激基因、解毒基因和免疫相关基因的扩增或差异表达。q RT-PCR验证基因表达谱中一部分差异显著基因的表达变化与表达谱变化趋势一致。【结论】对基因的差异表达和细胞毒性检测进行了研究,为对硫磷新的作用靶标和抗性机制研究奠定了基础。     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒fp25k基因的改造及用于稳定转化Sf9昆虫细胞系

【目的】苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)在昆虫细胞中连续传代以后,会出现从多多角体表型到少多角体表型的转变,这种转变与一个编码25 kDa蛋白的基因（few polyhedra, fp25k）突变失活有关。杆状病毒的fp25k基因突变后产生的包涵体（多角体）衍生病毒粒子变少而出芽型病毒粒子增加,会降低外源基因在杆状病毒表达系统中的表达。本研究拟改造fp25k并构建能持续表达FP25K蛋白的转基因昆虫细胞,以克服杆状病毒, fp25k基因易突变导致的表达系统缺陷。【方法】本实验通过改造杆状病毒, fp25k基因在细胞传代过程中容易产生突变的位点,得到 mfp25k,并将mfp25k构建到pIZT/V5-His载体上,重组载体转染Sf9细胞,通过Zeocin抗性筛选逐步淘汰未成功转化的Sf9细胞。【结果】成功改造AcMNPV的, fp25k基因的TTAA位点,得到pIZT-mfp25k重组载体。重组载体成功转染Sf9细胞,通过Zeocin抗性筛选后获得基因组中带有mfp25k的Sf9-mfp25k稳定的转基因细胞系。用AcMNPV的fp25k突变型病毒AcP2感染转基因Sf9-mfp25k昆虫细胞系与正常Sf9细胞,发现转基因Sf9-mfp25k昆虫细胞系表达的FP25K蛋白可弥补病毒, fp25k基因突变的缺陷。【结论】建立的Sf9-mfp25k转基因昆虫细胞系通过细胞表达FP25K蛋白,可以弥补因杆状病毒fp25k基因突变产生的缺陷。研究结果为构建稳定的杆状病毒 昆虫细胞表达系统提供了新途径。     

重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达

【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β (PDGFRβ)链膜外区与人IgG Fc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97 kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过Protein A亲和层析,获得了纯度达75％以上,表达量为1 μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c 3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。     

不同土壤类型和含水量下金龟子绿僵菌对红火蚁的致病力

【背景】红火蚁是一种危险性入侵生物,虫生真菌对其防治效果会受到外界环境因子的影响。【方法】应用致病力测定的方法研究了不同剂量金龟子绿僵菌M09对红火蚁的毒力,同时研究了含水量和土壤类型对绿僵菌毒力的影响。【结果】红火蚁的死亡率与金龟子绿僵菌的剂量呈正相关,处理4 d后LC50为0.37 g。金龟子绿僵菌在砂土、壤土和粘土中对红火蚁的致死率均与对照差异显著,其中在砂土中的毒力最强。此外,在不同含水量的土壤中,金龟子绿僵菌的致死率也不相同(P0.01)。【结论与意义】土壤类型和土壤湿度会显著影响金龟子绿僵菌M09对红火蚁的防治效果。选择高湿和砂土类型的土壤施用金龟子绿僵菌M09可以达到较好的效果。     

金龟子绿僵菌及其粗毒素对樟巢螟幼虫的致病性

【目的】为了筛选感染樟巢螟Orthaga achatina幼虫的高致病力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae菌株,并研究绿僵菌粗毒素对幼虫的毒力和取食粗毒素后幼虫的血淋巴细胞免疫反应。【方法】以死亡率 时间几率值法和TDM模型分析绿僵菌及其粗毒素对樟巢螟幼虫的致病力,并显微观察处理幼虫的血淋巴细胞的变化。【结果】绿僵菌菌株Ma1291-2对樟巢螟幼虫有较强的致病力,以浓度(1.0±0.5)×108个孢子/mL的孢子悬液接菌11 d后,幼虫的校正死亡率和僵虫率分别为99.8%±2.6%和86.9%±1.3%,LT₅₀为6.29 d。各菌株产粗毒素水平与其对幼虫的校正死亡率和LT₅₀呈显著相关。通过时间-剂量-死亡率模型参数估算,Ma1291-2菌株及其粗毒素对幼虫致死效应较强的时间段分别为接菌后6-7 d和3-4.5 d。幼虫取食绿僵菌粗毒素后2 d,总血细胞、浆血细胞、珠血细胞和类绛血细胞浓度上升到最高值,而后下降;粒血细胞浓度2 d后开始极显著上升,第3天达到最高值后急速下降;原血细胞前3 d未发现有明显的数量变化,第4天显著下降。幼虫取食粗毒素3~4 d后,浆血细胞和粒血细胞有破裂,珠血细胞和类绛血细胞有黑化现象,原血细胞病态变化不明显。【结论】樟巢螟幼虫取食绿僵菌粗毒素后2-3 d,幼虫血淋巴细胞对粗毒素的免疫反应最强烈,且粗毒素对血细胞有毒害和破坏作用。本研究为该害虫的生物防治提供了一定的理论与应用基础。