溶藻弧菌噬菌体的分离

从海产品中检出29株溶藻弧菌噬菌体,从中选出4株进行鉴定。据噬菌斑特征可分为两类：一类是透明,一类是不透明。但大小各有差异,直径均在0．5—3.0mm。电镜可见形态也可分成两种类型：即头部呈长轴六角形,尾部细长,结构简单;另一类头部呈等轴六角形,但棱角不甚明显,尾部很短。这些噬菌体的增殖效价均可达108-9pfu／ml,对溶藻弧菌的综合裂解率为72.22％,单株平均裂解率在9.72—44．4％。4株噬苗体的特异性高,原液与612株属外常见菌作交叉裂解试验,均未出现交叉裂解现象;与697株属内弧菌I昊I试,也仅对副溶血弧菌有39.0％的交叉裂解,但将原液稀释至10RTD时,大部分交叉现象消失,表明两菌间有明显的亲缘关系。     

一株沙门氏菌裂解性噬菌体的分离鉴定及生物学特性

【目的】从贝类样品中分离到一株沙门氏菌裂解性噬菌体SLMP1,对其进行鉴定及生物学特性分析。【方法】采用双层平板法从贝类样品中分离沙门氏菌噬菌体SLMP1,观察噬菌斑特征,分析SLMP1的宿主范围;利用聚乙二醇8000沉淀浓缩SLMP1颗粒,用氯化铯等密度梯度离心纯化;采用透射电子显微镜观察纯化的SLMP1颗粒;采用酚-氯仿法提取SLMP1核酸,通过核酸酶处理分析核酸类型;分析SLMP1的热稳定性、pH稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线及裂菌效果。【结果】SLMP1噬菌斑直径约2–3 mm,圆形透明、边缘清晰;SLMP1能裂解肠沙门氏菌肠亚种和鼠伤寒沙门氏菌;SLMP1头部呈二十面体,直径约62 nm,含非收缩性尾部,尾长约110 nm,属于长尾病毒科;SLMP1核酸为双链DNA;SLMP1在30–60 °C稳定,在pH 4.0–11.0稳定,最佳感染复数为0.001,感染宿主菌潜伏期为10 min、裂解期为120 min、裂解量为51;SLMP1在液体环境中具有良好的裂菌效果。【结论】SLMP1属dsDNA长尾科裂解性噬菌体,具有沙门氏菌生物抑菌剂的应用潜力。     

副溶血弧菌噬菌体Vpas_PP24的分离鉴定及生物学特性

【背景】副溶血弧菌是南美白对虾养殖中常见的致病菌,传统的抗生素防治办法不仅低效,而且越来越难以满足食品安全和绿色环保及可持续发展的要求。副溶血弧菌的生物防治是南美白对虾养殖业可持续发展的必由之路。噬菌体是天然安全的活体抗菌剂,因其对特定细菌的专一性感染和高效性裂解而备受关注。【目的】分离一株能高效裂解副溶血弧菌的烈性噬菌体,为探索副溶血弧菌的噬菌体防治方法提供基础研究。【方法】以28株病虾来源的副溶血弧菌为宿主菌,用双层琼脂平板法从海鲜市场污水中分离副溶血弧菌噬菌体;点斑法测定噬菌体的裂解谱,并对筛选到的宽裂解谱噬菌体进行透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察、生物学特性测定和全基因组序列分析。【结果】分离筛选到一株副溶血弧菌烈性噬菌体,命名为Vpas_PP24。透射电镜观察显示该噬菌体头部为二十面体,有一长尾,头部长约92 nm,宽约46 nm,尾部长约147 nm,属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科。其基因组全长83 482 bp,预测有118个开放阅读框(open reading frames,ORFs),具有已知功能的有13个,不含非编码RNA、毒力基因及抗生素抗性基因。基因组一致性对比显示噬菌体Vpas_PP24可能为弧菌噬菌体的一个新种。Vpas_PP24对28株副溶血弧菌的裂解率为54%,对其他种属的116株弧菌的总裂解率为16%;最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.000 1,效价可达3.0×10¹⁰ PFU/mL。一步生长曲线显示Vpas_PP24的潜伏期为10 min,暴发期为150 min,暴发量为30 PFU/cell。该噬菌体在温度<50 ℃、pH 4.0-11.0范围内活性稳定,对糜蛋白酶、木瓜蛋白酶和对虾肝胰腺酶提取液的水解作用不敏感,但蛋白酶K可快速使其失活,紫外辐照也能使Vpas_PP24失活。宿主菌对该噬菌体的不敏感突变频率为2×10^-5。【结论】分离筛选到一株裂解谱较宽、基因型较新、生物学性质较稳定的副溶血弧菌噬菌体,该噬菌体具有进一步开发成为新型副溶血弧菌抗菌剂的潜力。     

一株副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定及生理特性

为了探寻有效的控制副溶血弧菌的方法, 从水产品市场的污水中分离出来一株烈性噬菌体qdvp001。采用双层平板法分离纯化噬菌体qdvp001, 电镜观察其形态特征, 并利用双层平板法测定其生理特性, 包括热稳定性试验、最适pH、最佳感染复数及一步生长曲线, 然后提取基因组进行酶切和序列分析。结果显示该烈性噬菌体qdvp001头部直径大约为79 nm, 尾长大约118 nm, 属于肌尾噬菌体科。它对60 °C以下的温度耐受力较强, 最适pH为7.0?8.0左右, 最佳感染复数是0.000 1, 感染宿主菌的潜伏期约20 min, 裂解期约70 min, 并获得部分DNA片段的序列。将获得的DNA序列在NCBI上进行比对, 结果显示, qdvp001与其他噬菌体的同源性较低。该噬菌体很可能是一种新发现的噬菌体。     

一株新型旱獭源性宽谱大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及基因组分析

[目的]分离喜马拉雅旱獭肠内容物样本中的噬菌体,并研究其生物学特性和基因组特征。[方法]以大肠杆菌为宿主菌,利用双层琼脂平板法从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离噬菌体;用透射电镜观察形态特征;测定其最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱耐受度及宿主裂解谱等生物学特性,并进行全基因组测序。[结果]从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离得到一株裂解性大肠杆菌噬菌体,命名为vB_EcoM_TH18,其噬菌斑呈无晕环的透亮圆形,透射电镜观察发现该噬菌体头部直径为(90±5) nm,尾部长度为(115±5) nm;最佳感染复数为1;一步生长曲线显示其潜伏期为10 min,110 min后进入平台期,平均裂解量为15 PFU/mL;在pH 4.5-9.5的范围内具有稳定活性;可裂解多种致病型和血清型大肠杆菌和宋内志贺氏菌,无法裂解沙门氏菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌及鲍曼不动杆菌;基因组测序结果表明,其基因组长度为133 882 bp,GC含量为39.95%。基因组共注释到210个编码序列(CDS)和13个tRNAs,不含毒力基因及耐药基因。BLASTn比对结果表明该基因组与Avunavirus属噬菌体Av-05同源性为95.17%。基于噬菌体全基因组、主要衣壳蛋白和终止酶大亚基分别构建系统进化树,结果表明vB_EcoM_TH18是一株肌尾噬菌体科(Myoviridae) Avunavirus属的新型噬菌体。[结论]从喜马拉雅旱獭肠内容物中成功分离并鉴定了一株新型宽谱大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_TH18,可裂解多种致病型和血清型的大肠杆菌及宋内志贺菌。     

两株副溶血弧菌烈性噬菌体的分离鉴定

研究旨在筛选烈性噬菌体, 为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)病害防控增加新的选择。以副溶血弧菌Vp13为宿主菌, 通过二层琼脂平板法筛选, 分离到了2株烈性噬菌体SX-2和SX-F。对其形态结构进行了透射电镜观察, 利用DNase I、 RNase A、Mung Bean Nuclease和Hind Ш酶进行噬菌体核酸类型鉴定, 并对噬菌体的裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线进行了测定。透射电镜观察结果显示: SX-2核衣壳头部长约110 nm, 宽约50 nm, 尾部长约150 nm, 宽约10 nm, 为典型的复合体制; SX-F核衣壳呈正六边形, 长约为56.86 nm,宽约50.74 nm, 未观察到尾部, 推测为正二十面体对称; 核酸测定结果显示两者均为线性双链DNA。依据国际病毒分类委员会第九次报告, SX-2符合肌尾噬菌体科特征, SX-F符合盖噬菌体科特征。噬菌体SX-2和SX-F对85株弧菌裂解结果显示: 噬菌体SX-2能够裂解23株副溶血弧菌和1株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 噬菌体SX-F能够裂解19株副溶血弧菌和1株溶藻弧菌。SX-2和SX-F的最佳感染复数均为0.0001。一步生长曲线结果显示: SX-F的潜伏期约10min, 裂解期约70min, 裂解量为116.2; 噬菌体SX-2的潜伏期小于10min, 裂解期大约70min, 裂解量为209.3。两株噬菌体生物学特性表明SX-2与SX-F均为烈性噬菌体, 这为进一步探讨噬菌体防治技术奠定了基础。     

氨氮胁迫下凡纳滨对虾抗病力和副溶血弧菌噬菌体防病效果研究

在水体不同氨氮条件下,对对虾抗病力指标和副溶血弧菌噬菌体生物防治效果进行了研究。实验设置0．05mg／L（对照）、0．15mg／L低浓度组、0．75mg／L低浓度组、1．50mg／L中浓度组、3．00mg／L高浓度组5个氨氮的质量浓度作为胁迫组,计在此基础上加入副溶血弧菌设置感染组,加入副溶血弧菌和噬菌体设置噬菌体防治组。在胁迫组,低浓度氨氮使凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei血清P0、ACP和SOD活力增强,但是在第14天时所有实验组对虾的THC、虮清PO、CAT、ACP、SOD活力均远低于对照组,差异显著（P〈0．05）。感染组对虾THC、血清PO、CAT、ACP、SOD活力受到显著影响,各实验组的对虾抗病力指标均低于相对应的胁迫组,差异显著（P〈0．05）。低浓度氨氮的噬菌体防治组各项指标与感染组比较差异显著（P〈0．05）,肝胰脏的副溶血弧菌计数的差异显著（P〈0．05）。在第14天时,低浓度氨氮防治组指标和感染组差异显著（P〈0．05）,和胁迫组相近。以上结果说明噬菌体防治弧菌病在水体低浓度氨氮条件下,有更好的效果。     

副溶血弧菌CHY5-M1M噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

副溶血弧菌引起的疾病给水产养殖行业带来巨大损失,而随着抗生素的禁用,人们开始探索治疗水产动物病菌的新型方法,如噬菌体治疗法。从青岛市城阳水产品批发市场采集了15份海产品养殖水及下水道污水样品,以副溶血弧菌作为宿主菌,采用点滴法分离纯化获得12株副溶血弧菌噬菌体,通过双层平板法研究副溶血弧菌噬菌体CHY5-M1M的最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH的稳定性以及对紫外线的敏感度等生物学特性。结果显示,CHY5-M1M噬菌体效价为8.65×10¹³CFU·mL^-1,且在100感染复数时效价最高;一步生长曲线的潜伏期为20 min,裂解时长100 min,140min后达到平稳期;噬菌体在温度为40℃时效价最高,高于60℃时活性开始下降;噬菌体pH适应范围为5～11;噬菌体浓度随紫外照射时间增加明显下降;噬菌体基因组共43 193 bp,包含44个基因,无毒力因子基因和抗生素耐药基因。研究结果表明,噬菌体CHY5-M1M在开发新型抗弧菌药物、预防治疗严重海水动物弧菌病等方面具有良好的应用前景,有望作为未来的抗生素替代产品。     

一株裂解性奶牛乳房炎源大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

【目的】从新疆石河子地区奶牛粪样中分离裂解性大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage),对其进行纯化及生物学特性分析。【方法】利用双层平板法从奶牛粪样中分离、纯化噬菌体,将纯化后的噬菌体浓缩液用醋酸双氧铀负染后通过透射电子显微镜观察其形态特征。对该噬菌体进行全基因组测序和遗传进化分析,同时测定噬菌体的宿主谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性及酸碱稳定性。【结果】分离并纯化出一株裂解性噬菌体vB_EcoM_XJ2,噬菌斑圆形不透明,直径0.7 mm–1.2 mm;电镜显示其头部呈正多面体对称,有可伸缩性尾部;核酸类型为双链DNA,基因组大小为75.617 kb,G+C%含量为42.09%;其核酸序列与大肠杆菌噬菌体NJ01和vB_EcoP_SU10相似性高达94%。生物学特性研究显示该噬菌体能裂解多株临床分离的大肠杆菌;能耐受60°C左右高温,在pH 5.0–11.0范围内效价稳定;最佳感染复数为0.1,潜伏期为15 min,暴发期为95 min,裂解量约为10.6 PFU/cell。【结论】vB_EcoM_XJ2是一株在不同温度、不同酸碱性环境中有较强适应能力的裂解性肌尾科大肠杆菌噬菌体。     

一株金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定与生物学特性

[背景]金黄色葡萄球菌作为一种条件致病菌,在临床感染中扮演着重要的角色,需要研究更多更有效的防治手段.[目的]分离金黄色葡萄球菌噬菌体,研究其生物学特性,从而为金黄色葡萄球菌的替代防治提供理论借鉴.[方法]以金黄色葡萄球菌D085为宿主从污水中分离得到一株噬菌体,命名为vB_SauS_SAP3,用PEG8000浓缩、氯...     

溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株的构建及其表型特征

【目的】探究kdpD基因对溶藻弧菌生物学特性的影响。【方法】采用Overlap PCR和同源重组技术,结合正负向筛选,构建kdpD基因无标记基因框内敲除突变株,比较kdpD突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差异。【结果】成功构建溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株。体外实验表明,kdpD的缺失对溶藻弧菌的生长曲线和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力和生物被膜形成能力出现下降。斑马鱼致病性试验结果显示,突变株毒力下降了8.84倍。【结论】kdpD基因参与调控溶藻弧菌的泳动能力、被膜形成和毒力,但不影响生长速率和胞外蛋白酶活性。     

海洋蛭弧菌的分离鉴定及其对副溶血弧菌的作用

蛭弧菌广泛存在于自然水体, 具有噬菌的特性, 对水体中细菌数量控制具调节作用。以副溶血弧菌为宿主菌, 利用双层琼脂法, 从海洋水体中分离出15株具有噬菌作用的细菌, 对形成噬菌斑能力最强的1株菌株进行特异性16S rDNA扩增, 确认为蛭弧菌, 命名为Bd-M1。Bd-M1对大多数海水养殖动物病原菌有裂解作用, 裂解率在90%(20/22)以上, 模拟水环境实验发现, 蛭弧菌对副溶血弧菌有较强的裂解和净化作用, 102 h内能使副溶血弧菌从3.0′108 CFU/mL下降到8.7×103 CFU/mL。动物实验表明蛭弧菌能有效预防对虾弧菌病的发生, 表明蛭弧菌有望成为水产动物疾病防治的一种有效的生物制剂。     

Measurement of the activity of attached bacteria using a sorption microcalorimeter

A method is described in which a flow sorption microcalorimeter was used to measure the heat production of Vibrio alginolyticus attached to polyacrylamide beads. Starved cells were attached to the beads and placed in the column of the calorimeter. Heat production from the metabolism of glucose by the attached cells was then determined. The specific rate of heat production of cells on the surface is compared with that of cells growing in solution. The results show a lowered rate of heat production per cell by the attached bacteria.     

溶藻弧菌诱导凡纳滨对虾消减文库的构建及其表达序列标签分析

利用抑制消减杂交技术构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)诱导的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴细胞cDNA文库。用DNAMAN5.2.2软件对560条高质量的ESTs进行聚类,共获得239个Unigenes。与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比较,其中66.9%为已知功能基因,33.1%为未知功能基因,GO分类将其分为7类,包括能量和基础代谢类相关的基因为第一大类占36%,免疫相关基因占15%,其他基因占8%,信号转导类占3%,抗氧化酶和凋亡相关蛋白均为2%,核蛋白类占1%。实验结果表明凡纳滨对虾在溶藻弧菌诱导下可产生一系列特异基因的表达,通过对文库的分析显示,基于PCR方法建立的SSH文库为取得大量免疫相关基因的ESTs序列提供了可能。       

Development of monoclonal antibodies for simple identification of Vibrio alginolyticus

AIMS: The present study was aimed to produce monoclonal antibodies (MAbs) for simple and specific identification of Vibrio alginolyticus infection in shrimp. METHODS AND RESULTS: Mice were immunized with heat killed V. alginolyticus four times at 2-week intervals. The best response mouse was used for spleen donor in hybridoma production. Screening of hybridoma clones producing desired antibodies was performed by dot blotting against V. alginolyticus and other bacterial species, Western blotting and immunohistochemistry of infected shrimp tissues. Four groups of MAbs were obtained; the first group of MAbs demonstrated their limited specificity only to V. alginolyticus used for immunization, while the second and the third groups recognized all three isolates of V. alginolyticus used for testing. The fourth group of MAbs bound to all three isolates of V. alginolyticus and also recognized Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio fluvialis and Vibrio vulnificus but did not bind to Vibrio mimicus, Vibrio cholerae, Vibrio penaeicida and other bacterial species tested. MAbs in groups 1, 2 and 3 were able to use for the detection of bacterial infection in the tissues by means of immunohistochemistry. CONCLUSIONS: MAbs specific to V. alginolyticus was produced. These MAbs can be used for specific identification of the bacteria by simple 'dot blotting' method and immunohistochemistry. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: This study demonstrated an immunological tool that can be used for simple and accurate identification of V. alginolyticus as well as for the diagnosis of V. alginolyticus infection in animals. This immunological tool can replace costly and laborious biochemical tests.     

溶藻弧菌ZJ-T小RNA srvg23535基因突变株的构建及其功能初探

【背景】小RNA被证实对细菌遗传变异、生长繁殖、致病性等具有重要的调控作用,但是在机会致病菌——溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)中研究较少。本实验室前期通过转录组测序和Northern Blot鉴定得到溶藻弧菌ZJ-T中小RNA srvg23535。【目的】初探小RNA srvg23535对溶藻弧菌生物学特性的影响。【方法】利用同源重组技术构建小RNA srvg23535的缺失突变株,并对野生株和srvg23535突变株的菌落形态、运动性、胞外蛋白酶分泌、H_2O_2和Cu~(2+)的压力感应、铁吸收利用、抗生素抗性以及生长代谢等生物学特性进行比较研究。【结果】通过对溶藻弧菌小RNA srvg23535基因缺失突变株的生物学特性分析表明,小RNA srvg23535缺失后,对溶藻弧菌菌落形态、运动性、胞外蛋白酶分泌、H_2O_2和Cu~(2+)的压力感应、铁吸收利用、抗生素抗性以及多数测定的碳源、氮源代谢的影响不显著;但突变株对D-海藻糖(D-trehalose)的代谢减弱,对果胶(Pectin)、丙氨酸-谷氨酰胺(Ala-Gln)的代谢增强,并可利用丙氨酸-天冬氨酸(Ala-Asp)为氮源。【结论】小RNA srvg23535参与调控溶藻弧菌对D-海藻糖(D-trehalose)、果胶(Pectin)、丙氨酸-谷氨酰胺(Ala-Gln)和丙氨酸-天冬氨酸(Ala-Asp)的代谢,这将为获取srvg23535调控靶标基因,进而阐明其与靶标基因的相互作用机制奠定基础。     

溶藻弧菌中类霍乱弧菌毒力岛转座酶基因及侧翼序列分子生物学特征分析

[目的]调查类似霍乱弧菌毒力岛(VPI)转座酶(vpiT)的基因是否在溶藻弧菌中分布,并了解其全序列及侧翼序列的分子生物学特征.[方法]对94株溶藻弧菌是否携带类似VPI的vpiT基因进行PCR检测,对阳性株进行了PCR产物直接测序,根据获得的部分已知序列,设计引物,通过反向PCR扩增出全长类似vpiT的基因valT及部分侧翼片段,对反向PCR产物进行克隆测序,然后对获得的valT及侧翼序列进行生物信息学分析.[结果]发现94株溶藻弧菌中只有从粤东对虾池水分离的2个株E06011、E0612在PCR检测中产生了预期扩增片段.测序表明两者序列(valT-S1)完全一致.根据反向PCR及克隆最终获得的溶藻弧菌E0601全长valT基因及部分侧翼序列valT-S3.对valT-S3生物信息学分析表明:valT是一个高度类似于霍乱弧菌毒力岛vpiT的转座酶基因.[结论]根据上述结果及相关文献,有理由相信valT基因及其侧翼片段是异源获得,霍乱弧菌VPI元件或整体很可能在包括溶藻弧菌在内的弧菌种间转移.     

红鳍东方鲀病原鱼肠道弧菌的生物学特性研究

对引起红鳍东方鲀发病死亡的病原细菌进行了分离和主要生物学特性研究,包括病原性、形态特征、理化特性、16S rRNA基因序列及其系统发育学分析、胞外酶及溶血素活性、K抗原及耐药性等.结果表明,引起红鳍东方纯发病死亡的病原细菌为弧菌属(-Vibrio Pacini 1854)的鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri Ishimaru,et al.1996),2株代表菌株16S rRNA基凶序列(GenBank登录号分别为:EF611424和EF635304)与GenBank数据库中鱼肠道弧菌的同源性在98%-100%,且在构建的MP系统发生树中与鱼肠道弧菌聚为一个分支.分离菌不具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、DNA酶、脲酶、明胶酶和卵磷脂酶活性,且在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上不溶血.不具有K抗原.人工感染试验中分离菌对红鳍东方纯表现出明显的致病性.药敏试验结果显示,4株分离菌对供试37种抗菌药物中的苯唑青霉素和杆菌肽2种耐药.     

鱼源溶藻弧菌胞外产物的特性研究

溶藻弧菌经胰胨大豆胨琼脂培养基(TSA 2%NaCl)培养48h后,培养物用PBS洗脱、离心,再经孔径0.22μm微孔滤膜过滤,制得胞外产物(Extracellular product,ECP)。经检测,该ECP具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等4种酶活性,其中淀粉酶的活性最高,酪蛋白酶、脂肪酶活性次之,卵磷脂酶活性较低,未检测出明胶酶及脲酶活性;能溶解断斑石鲈(Pomadasys hasta)、眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)和赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的红细胞,而不能溶解鸡、羊及O型人红细胞;对小白鼠和石斑鱼的LD50分别为0.08mg/g和0.17mg/g,95%可信限分别为0.06—0.12mg/g和0.07—0.28mg/g;50mmol/L EDTA和100mmol/L苯甲基磺酰氟能使胞外蛋白酶(Extracellular pro-teinase,ECPase)的活性分别下降83.40%和51.32%;ECPase对热稳定性较差,碱性条件下活性较高,其最适温度为50℃,最适pH为8.0。