骨髓基质细胞的特征及其在细胞和基因治疗中的应用

骨髓基质细胞是一类独特的间质干细胞,可分化为多种非造血系的组织。骨髓基质细胞具有贴壁生长的特性,因而易于在体外分离和扩增;另外骨髓基质细胞可在体内外表达多种治疗性的外湖目的基因。因此,骨髓基质细胞被认为是一种理想的治疗性细胞的基因治疗中的靶细胞。本文对骨髓基质细胞的研究进展及其在细胞和基因治疗中的应用作一综述。     

壳聚糖及其改性材料对骨髓基质细胞的作用

壳聚糖是一种广泛应用的生物可降解材料,该论文研究了几种与壳聚糖相关的材料对骨髓基质细胞生长和分化的作用,主要实验方法是在材料表面培养骨髓基质细胞并对其进行诱导促使其向成骨细胞方向分化。通过对细胞生长和分化情况的观察和测定,对几种材料与骨髓基质细胞的亲和性作出了评价。另外,通过ELISA法测定了细胞外基质分子在材料上的吸附量,测量了各材料的表面接触角以研究细胞在材料表面的铺展和增殖。结果表明尽管壳聚糖本身与骨髓基质细胞并不具有很好的亲和性,但通过与明胶混合,壳聚糖的生物相容性得到了明显提高,是很有应用前景的骨修复材料。     

骨髓基质细胞在细胞移植与基因治疗中的应用

骨髓基质细胞是研究最广泛的成体干细胞,用于临床细胞移植与基因治疗有诸多优点,论述了具有多向分化潜能的骨髓基质细胞,应用于细胞移植与基因治疗中的研究现状及发展前景 。     

人骨髓基质细胞的长期培养及其对病毒的敏感性

为了长期培养骨髓基质细胞和研究其对病毒的敏感性,我们采用静置贴壁培养法,体外长期培养了胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞,并将传至５代以上的肌样骨髓基质细胞采用微量细胞病变（ＣＰＥ）法,开展了对５种病毒的敏感性试验。结果表明,人骨髓基质肌样细胞对滤泡性口腔炎病毒,脊髓灰质炎病毒、Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均敏感,能产生明显的ＣＰＥ,其效价（ＴＣＩＤ５０）可达１０＾－３～１０＾－４,其中胎儿骨髓基质肌样细胞对     

人体骨髓长期培养中粘壁层的基质细胞

应用免疫荧光技术对人体骨髓长期培养(HLTBMC)粘壁层细胞作了研究,发现在不同的基质细胞中有着下列表面标记:基质成纤维细胞CD 10~+,FIB 86.3~+,CD 13~+,CD 71~+;脂肪细胞CD 10~+,FIB 86.3~+,CD 13~+,CD71~+/-,CD 14~+,CD 33~+,CD 25~+,HLA-DR~+,CD 19~+,CD 5~+,基质成纤维细胞的标记与两次传代的骨髓成纤维细胞以及皮肤和脾脏的成纤维细胞相似。HLTBMC中的成纤维细胞较之非巨噬细胞的小圆形造血细胞,数量上占很大的优势,加之镀银染色发现网状纤维增多,提示HLTBMC后期造血活性的消失可能与临床上的骨髓纤维化有着相似的机理。     

低温冻存对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的：探讨低温冻存对骨髓细胞和贴壁基质细胞生物学特性的影响。方法：取新鲜骨髓和经Dexter法培养14d的骨髓贴壁基质细胞(称“基质细胞”),经-196℃液氮冻存(前者称“冻存骨髓”,后者称“冻存基质细胞”)2周,复温,再用Dexter法培养这些细胞,检测细胞增殖、细胞形态、细胞化学染色、细胞表面抗原及基质细胞支持另一骨髓造血细胞形成的鹅卵石造血区(CAFC),长期培养起始细胞(LTCIC)的变化,比较冻存对骨髓细胞和基质细胞生物学特性的影响。结果：生长特性：冻存骨髓比新鲜骨髓、冻存基质细胞比新鲜基质细胞培养后融合成片的时间延迟,细胞增殖数比也有减低。细胞成分：冻存骨髓比新鲜骨髓形成的成纤维细胞、内皮细胞比率下降,而巨噬细胞和脂肪细胞比率升高,冻存基质细胞上述现象更明显：冻存后含凋亡小体的细胞在骨髓细胞和基质细胞内均有增加。细胞表面抗原：冻存骨髓、冻存基质细胞CD14、HLA-DR抗原表达百分率比新鲜骨髓、新鲜基质细胞高,CD45、CD33反之。支持造血：冻存前后骨髓和基质细胞支持形成的CAFC和LTC-IC,生长良好,无显著差异。结论：骨髓细胞和经培养生成的贴壁基质细胞,经冻存和复温,生物学特性有一定变化,但仍可以保留良好的支持造血重建功能。     

大鼠骨髓基质细胞的培养及生物学特性鉴定

目的:分离、培养大鼠MSCs,对其生物学特性进行鉴定.方法:取大鼠长骨中的骨髓组织,以贴壁法培养分离大鼠MSCs,经多次传代得到较纯的MSCs,倒置相差显微镜下观察细胞形态,应用免疫细胞化学方法对细胞的表面抗原标志进行检测.取3代MSCs,B-ME诱导6小时候后,倒置相差显微镜下观察细胞形态,应用免疫细胞化学方法鉴定诱导后细胞的表型特征.结果:倒置相差显微镜观察发现,接种后24h,细胞开始贴壁.培养3代以后,细胞呈梭形或多角形,折光性好,核为圆形、居中.免疫细胞化学检测细胞表面抗原显示:CD34-、CD45-、CD29+、CD44+、CD90+.诱导后细胞发出突起,逐渐生长延伸并彼此相连,形态学上具有神经细胞的明显特征.免疫细胞化学显示诱导后细胞NSE(神经元特异性烯醇化酶)阳性.结论:所采用的细胞分离培养方法简便可行,所获得的细胞其表型特征与文献报道一致,且具有向神经细胞分化的潜能.     

骨髓基质细胞与神经损伤和神经退行性疾病

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)又名成纤维细胞样克隆形成单位(fibroblast colonyforming units,CFU-F)、间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、间质祖细胞(mesenchymal progenitor cells．MPCs)。本文统一用BMSCs这一概念,对其生物学特性及其神经损伤修复作用进行综述。     

hBMP2转基因载体的构建及其在兔骨髓基质细胞中的表达

目的构建hBMP2真核表达载体pcDNA3-hBMP2,将其转染兔骨髓基质细胞(Marrow Stromal Cells,MSCs)并检测其表达效率。方法将hBMP2的cDNA构建于真核表达载体pcDNA3,形成重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,酶切鉴定后体外转染培养状态下的兔骨髓基质细胞,用原位杂交和免疫组织化学方法鉴定表达情况并用计算机图像分析系统测定其表达效率。结果pcDNA3-hBMP2载体酶切鉴定与预期片段相符,表明成功构建了pcDNA3-hBMP2转基因载体。用该载体转染兔骨髓基质细胞后获得了瞬时表达和稳定表达。结论载体pcDNA3-hBMP2可以在骨髓基质细胞中表达,为下一步将其用于转基因骨组织工程研究奠定基础。     

骨髓基质干细胞的诱导分化及其治疗癫痫的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞的方法及脑内移植治疗大鼠癫痫模型的作用。方法无菌条件下分离纯化BMSCs,用bFGF 10ng/ml、RA0.5μmol/L的DMEM/F12诱导72h后,部分用于免疫荧光检测nestin,其余的继续用bFGF 10ng/ml、RA 0.5μmol/L及神经营养因子NT-3 20ng/ml、BDNF 20ng/ml的DMEM/F12诱导4d,检测GAD67。皮下注射匹罗卡品建立癫痫大鼠模型,采用行为学分析筛选模型。通过立体定位仪,用微量注射器将BMSCs来源的神经干细胞和神经营养因子移植入癫痫鼠海马内,观察大鼠行为变化,存活2、4周后,心脏灌注取脑,冰冻切片免疫组化双标检测移植细胞的存活、迁移、分化情况。结果BMSCs诱导72h后,nestin表达阳性,4d后GAD67检测60%阳性。采用匹罗卡品造模,方法简便,但死亡率较高,仅15%-20%的动物造模成功。BMSCs源神经干细胞移植后可在海马内存活,向周围的脑区内迁移和整合。结论BMSCs源的神经干细胞在体外可诱导为γ-氨基丁酸能神经元并且对慢性癫痫有一定的治疗作用。     

骨髓基质细胞与交联明胶-聚羟基丁酸酯膜的生物相容性研究

目的研究生物材料交联明胶-聚羟基丁酸酯膜与骨髓基质细胞的生物相容性,探讨新型材料在骨组织工程中的应用前景。方法体外培养兔骨髓基质细胞,分别接种于G-PHB(交联明胶-聚羟基丁酸酯)、PHB(聚羟基丁酸酯)和G(交联明胶)材料膜片。采用MTT法检测细胞增殖活性,体视学方法检测细胞粘附能力,荧光双染法检测细胞完整性,扫描电镜观察细胞-材料界面。结果MTT检测发现G-PHB组增殖活性最强,而且表现为最佳的细胞粘附特性,与对照组比较差异有显著性意义。各组细胞完整性分析没有发现显著性差异。扫描电镜观察显示,G-PHB组细胞粘附及铺展良好,优于其他各组。结论交联后的生物降解膜材料G-PHB与BMSCs细胞的体外相容性明显优于单纯膜材料PHB和明胶,在骨组织工程学领域具有良好的研究价值和应用潜力。     

骨髓基质干细胞向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞在体外和体内向心肌细胞诱导分化的能力,为下一步的细胞移植治疗心肌梗死提供实验基础.方法体外诱导实验中,将不同浓度的5-氮胞苷作用于不同培养时间的骨髓基质干细胞,摸索5-氮胞苷的最佳诱导时机和浓度,观察诱导后细胞形态变化,并用免疫细胞化学染色检测心肌特异性肌钙蛋白T的表达;在体内实验中,培养扩增的骨髓基质干细胞经BrdU标记后,自体移植于正常心肌内,分别通过BrdU和心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测移植细胞的存活和分化情况.结果体外诱导实验中,5-氮胞苷的诱导作用以10μmol/L的浓度对传代细胞进行两次诱导,效果最好,不仅能诱导出表达心肌特异蛋白的心肌样细胞,而且这些细胞在体外能够自发搏动.体内诱导实验中,移植的细胞在正常心肌微环境中能够存活并分化为心肌细胞.结论骨髓基质干细胞在体外化学诱导和体内心肌微环境诱导时均能分化为心肌细胞,可用于细胞移植治疗心肌梗死的实验.     

小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁层对红系祖细胞生长的影响

本实验以Dexter培养体系作小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁培养。在所获的基质细胞贴壁层上作红系造血祖细胞集落培养,观察两种来源造血基质细胞对红系集落生长的影响。实验结果表明,胎肝造血基质细胞贴壁层能明显促进早期红系造血祖细胞(BFU-E)形成集落,却不明显影响晚期红系造血祖细胞(CFU-E)的生长。成年小鼠骨髓造血基质细胞贴壁层对BFU-E和CFU-E均有刺激生长的作用;但对前者生长的刺激性影响较胎肝造血基质细胞贴壁层为弱。造血基质细胞贴壁层对红系集落生长的促进作用主要是通过体液因子实现的,细胞间短距离调节的影响亦不能除外。     

神经妥乐平体外诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞

目的探索神经妥乐平(NT)体外诱导大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,rMSCs)分化为神经元样细胞的可行性,以期为临床应用MSCs治疗神经系统疾病奠定基础。方法取一月龄SD大鼠骨髓,分离出MSCs进行培养、扩增、纯化。用NT诱导MSCs分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定阳性细胞。结果MSCs经诱导后胞体变圆,伸出细长突起,呈神经元样形态。免疫组化鉴定显示(31.50±7.32)%的细胞表达NSE阳性,(45.30±9.38)%的细胞表达GFAP阳性。结论MSCs在体外可被NT诱导分化为神经元样细胞。     

脱细胞神经移植物对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探讨脱细胞神经移植物诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞的可行性。方法将分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增,行表型鉴定后,取第5代细胞,诱导组采用脱细胞神经移植物匀浆进行诱导,非诱导组加入等量无血清培养基,倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测诱导后细胞S-100,神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的表达情况。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,免疫细胞化学染色GFAP、S-100的阳性表达率分别为为(42±4)%和(64±5)%。结果 脱细胞神经移植物可诱导骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞。     

施万细胞条件培养基对大鼠骨髓间质细胞的诱导分化作用

目的　探讨施万细胞条件培养基对大鼠骨髓间质细胞的诱导分化作用。方法　从大鼠骨髓中分离培养间质细胞并传至第 6代 ,诱导前 2 4h加 1μg·L-1碱性成纤维生长因子 (bFGF)入培养液中以促分裂 ,再以施万细胞条件培养基作诱导剂 ,观察细胞形态的变化 ,并采用免疫组织化学法对诱导后一周的细胞进行Map 2及NSE、GFAP表达的检测。结果　诱导后 48小时间质细胞在形态上表现为神经元样 ,神经元样细胞呈Map 2及NSE阳性 ,而GFAP显阴性。结论　施万细胞的上清液能诱导骨髓间质细胞分化为神经元样细胞。     

秋水仙碱（COM）诱发小鼠骨髓细胞C—有丝分裂效应的研究

本文以101/E1和C3H/E1的杂种第一代小鼠为材料,一次性腹腔注射秋水仙碱(COM)后,于不同时间取材,观察分析了小鼠骨髓细胞有丝分裂指数(MI)和C-有丝分裂的变化。结果表明:COM处理后2小时,MI和C-有丝分裂均已达到最高;并随处理时间延长而降低;至18小时,MI已降到(1mg/kg)或显著低于(3mg/kg)对照水平,而C-有丝分裂仍显著高于对照组。并对COM影响MI的可能机制以及C-有丝分裂效应与非整倍体诱导活性之间的关系进行了讨论。     

逆转录病毒介导的人血小板生成素(TPO)在骨髓基质细胞中的表达

为探讨逆转录病毒介导的TPO基因在人骨髓基质细胞系HFCL中的表达,利用脂质体法将含TPO基因的逆转录病毒载体导入HF-CL细胞中,RT-PCR和基因组DNAPCR分析证实mRNA水平有表达,基因组中整合有Neo基因和TPO基因。TPO依赖细胞株TD-3检测生物学活性表明转染的骨髓基质细胞分泌TPO。上述结果为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血细胞的调控作用提供了必要的基础资料。