锤头状核酶在HepG2.2.15细胞内的抗HBV特性

乙型肝炎病毒 (HBV)C基因区的 3′端序列在HBV各亚型中是高度保守的 ,它编码的多肽链都富含精氨酸 ,同时与前基因组RNA的包装和病毒DNA的复制有关。因此 ,HBV中C基因的 3′端保守区是核酶介导的抗病毒研究的理想靶位点。针对上述位点设计了锤头状核酶RzC ,同时作为对照 ,设计了相应的突变型核酶dRzC。HepG2 .2 .15细胞系是由头尾相接的HBVayw亚型基因组转染肝癌细胞系HepG2而建立的一株能稳定分泌HBV各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系。因而用HepG2 .2 .15细胞进行核酶的抗病毒研究更接近于疾病的治疗过程。为此 ,把体外转录的核酶RzC和dRzC以及核酶表达载体pCRzC和 pCdRzC直接转染HepG2 .2 .15细胞。初步结果表明 ,体外转录的核酶RzC对HBV复制的抑制很弱 ,这可能是由于核酶在细胞内快速被RNA酶降解造成的 ;而通过内源性传递产生的核酶RzC能够明显地抑制HBV的复制。结果说明 ,锤头状核酶RzC在HepG2 .2 .15细胞内显示抗病毒感染的能力 ,有可能作为HBV基因治疗的一种手段     

tRNA-包埋核酶在HepG2细胞中的抗HBV活性

已知 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶比裸露核酶在胎牛血清和 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞抽提液中有较高的稳定性 构建了 ｈ Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动下的抗 Ｈ Ｂ Ｖ（ａｄｒ 亚型）的 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶基因质粒,与携带 Ｈ Ｂ Ｖ 基因的ｐ１２Ⅱ质粒共转染 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞,用 Ｇ４１８ 筛选抗性细胞 分析稳定表达细胞中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ, Ｈ Ｂ Ｖ 抗原合成和新生 Ｄ Ｎ Ａ 合成,表明ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶比裸露核酶有较高的抑制 Ｈ Ｂ Ｖ 活性．ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶和裸露核酶分别使靶 Ｒ Ｎ Ａ 减少 ８２％ ～８７％ 和 ７５％ ～８１％ ,抗原减少 ７３％ ～８０％ 和７０％ ～７４％ 以及新生 Ｄ Ｎ Ａ 减少 ７４％ ～７６％ 和 ６７％ ～７１％ 结果指出,核酶,特别是 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶,对 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞中 Ｈ Ｂ Ｖ 表达和复制有明显抑制作用,可能作为 Ｈ Ｂ Ｖ 基因治疗的手段之一      

作用于HBV（adr亚型）RNA的tRNA—包埋锤头状核酶的研究

设计了针对ＨＢＶ（ａｄｒ亚型）ＲＮＡ的二个锤头状核酶（ＲＳ３和ＲＣ２）,并将其插入ｔＲＮＡ反密码环中（ＲｔＳ３和ＲｔＣ２）,以增加其稳定性。实验表明,虽然插入ｔＲＮＡ中的核酶与裸露核酶相比,催化活性有所下降,但在胎牛血清和ＨｅｐＧ２细胞抽提液中的稳定性却明显提高。因此,ｔＲＮＡ－包埋核酶有可能提高在体内的抗病毒能力。     

丙型肝炎病毒特异性核酶对HepG2.9706细胞HCV5′NCR基因表达的抑制作用

 为探讨锤头型核酶抗丙型肝炎病毒的作用 ,根据HCV 5′NCR及翻译起始区的二级结构 ,设计及合成了 1个锤头型核酶RzA .将其插入pCI neo表达载体的多克隆位点 ,构建了表达RzA的质粒pHCV RzA .采用转基因细胞模型HepG2 970 6细胞 ,评价了pHCV RzA质粒对HCV 5′NCR调控荧光素酶表达的抑制活性 .结果表明 ,在HepG2 970 6细胞中 ,pHCV RzA以序列特异性、剂量依赖性方式抑制荧光素酶基因的表达 ,抑制率达 80 % ,提示核酶有可能作为HCV感染基因治疗的一种有效途径 .     

针对不同基因靶位的锤头状核酶对HBV的抑制作用研究

前基因组mRNA是HBV(Hepatitis B virus)基因表达和复制的重要中间产物,全长的前基因组mRNA分子具有复杂易变的二级结构,是设计抑制HBV的核酶时所必须考虑的因素.我们使用多个最新的计算机软件对HBV前基因组mRNA二级结构进行模拟、分析,在全面分析核酶的可作用位点的基础上设计三个针对不同基因靶位的锤头状核酶,并对它们在细胞中对HBV的抑制作用进行研究.结果表明在HBV前基因组mRNA上存在几个高度复杂二级结构的区域,可能对核酶完全不敏感,而S、C、X基因的编码区是合适的核酶作用位点,都可达到对HBV的有效抑制,而且X基因位点的核酶对HBV的各种mRNA的抑制作用最为明显,是设计针对HBV核酶时应该优先考虑的位点.     

针对不同基因靶位的锤头状核酶对HBV的抑制作用研究

前基因组mRNA是HBV(Hepatitis Bvirus)基因表达和复制的重要中间产物,全长的前基因组mRNA分子具有复杂易变的二级结构,是设计抑制HBV的核酶时所必须考虑的因素。我们使用多个最新的计算机软件对HBV前基因组mRNA二级结构进行模拟、分析,在全面分析核酶的可作用位点的基础上设计三个针对不同基因靶位的锤头状核酶,并对它们在细胞中对HBV的抑制作用进行研究。结果表明在HBV前基因组mRNA上存在几个高度复杂二级结构的区域,可能对核酶完全不敏感,而S、C、X基因的编码区是合适的核酶作用位点,都可达到对HBV的有效抑制,而且X基因位点的核酶对HBV的各种mRNA的抑制作用最为明显,是设计针对HBV核酶时应该优先考虑的位点。     

锤头状核酶在鸡胚成纤维细胞中的对鹅副粘病毒SF02繁殖的抑制作用

针对鹅副粘病毒SF0 2的F基因 ,设计了锤头状核酶RzF5 98,并插入真核细胞表达载体pcDNA3获得该核酶的转基因质粒pcDNA RzF5 98。以无核酶功能的突变体dRzF5 98和pcDNA3空质粒为对照 ,分析核酶对病毒繁殖的抑制作用。结果表明 ,RzF5 98不仅能在体外成功切割靶基因的mRNA ,还能有效抑制SF0 2在鸡胚成纤维细胞中的繁殖。转染pcDNA RzF5 98的鸡胚成纤维细胞经SF0 2感染后存活率可达 80 %左右 ,而未转染任何质粒的细胞和转染pcDNA3空质粒的细胞经SF0 2感染后存活率只有约 5 %。转染dRzF5 98的细胞对病毒也具有一定抗性 ,这可能是由于反义RNA的作用。     

HepG2.2.15细胞中联合应用siRNA抑制HBV复制和表达的研究

观察联合应用siRNA对HepG2．2．15细胞中HBV抗原表达和复制的抑制作用。应用ELISA方法检测HBeAg和HBsAg;HBVDNA水平用实时定量PCR测定;用RT—PCR检测HBVmRNA水平。结果显示,实验中应用的HBV特异性siRNA均具有明显的抗HBV抗原表达和病毒复制作用;联合应用siRNA较单独应用具有更强的抗HBV作用。可见,HepG2．2．15细胞中联合应用siRNA对HBV复制的抑制作用比单独应用siRNA更有效。     

Threshold Occupancy and Specific Cation Binding Modes in the Hammerhead Ribozyme Active Site are Required for Active Conformation

The relationship between formation of active in-line attack conformations and monovalent (Na⁺) and divalent (Mg²⁺) metal ion binding in hammerhead ribozyme (HHR) has been explored with molecular dynamics simulations. To stabilize repulsions between negatively charged groups, different requirements of the threshold occupancy of metal ions were observed in the reactant and activated precursor states both in the presence and in the absence of a Mg²⁺ in the active site. Specific bridging coordination patterns of the ions are correlated with the formation of active in-line attack conformations and can be accommodated in both cases. Furthermore, simulation results suggest that the HHR folds to form an electronegative recruiting pocket that attracts high local concentrations of positive charge. The present simulations help to reconcile experiments that probe the metal ion sensitivity of HHR catalysis and support the supposition that Mg²⁺, in addition to stabilizing active conformations, plays a specific chemical role in catalysis.     

HBV影响XRN2基因在HepG2-H7细胞中表达的机制研究

目的利用稳定表达HBV的HepG2-H7细胞,研究HBV对XRN2基因表达的调控,并对其作用机制进行初步探讨。方法用RT—PCR和Real-time PCR的方法检测HepG2细胞及稳定表达HBV的HepG2-H7细胞中XRN2在mRNA水平的表达差异。构建XRN2启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒,分别转染HepG2细胞及HepG2-H7细胞,检测HBV对XRN2启动子的影响。将XRN2启动子质粒与HBV4种蛋白的真核表达质粒共转染HepG2细胞,寻找对启动子影响较大的HBV蛋白。结果RT—PCR和Real-time PCR的结果显示XRN2在HepG2-H7细胞中的表达较HepG2细胞有所下降。荧光素酶活性分析显示HBV能抑制XRN2启动子的活性,且HBx和HBp蛋白在这一过程中起主要作用。结论HBV蛋白可以通过抑制XRN2启动子活性调节其在HepG2-H7细胞中的表达。     

survivin在二烯丙基二硫诱导HepG2细胞凋亡中的作用

目的:研究survivin在二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导HepG2细胞凋亡中的作用。方法:MTT法检测细胞的生长活性;流式细胞仪检测细胞周期;RT-PCR法检测survivin mRNA水平;Western blot法检测survivin蛋白水平。结果:用药组HepG2细胞活性与正常组相比,随着药物浓度的增加(25,50,100,200μmol/l),分别下降了9．3%、10．4%、21．6%、31．2%,HepG2细胞凋亡率分别增加0．83%、1．97%、6．0%、9．9%,低浓度(25,50μmol/l)的DADS可以诱导survivin mRNA和蛋白表达升高,而高浓度的(100,200μmol/l)DADS可以降低survivin mRNA和蛋白表达。结论:DADS诱导HepG2细胞survivin表达增加,抵抗DADS诱导HepG2细胞的凋亡作用。     

甲壳胺对HepG2细胞蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶活性的影响

目的:初步探讨甲壳胺诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡的信号转导机制。方法:采用酶联免疫法,动态检测甲壳胺作用于Hep G2细胞后,细胞膜相及胞浆内的蛋白酪氨酸激酶(PTK)及蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性的变化。结果:甲壳胺可以抑制Hep G2细胞内的PTK活性,并呈一定的浓度依赖性;甲壳胺作用Hep G2细胞后,随着PTK活性的减弱,PTP的活性也短暂下降。结论:甲壳胺诱导Hep G2细胞凋亡时,涉及到PTK的活性改变。观察到膜相蛋白中PTK的活性改变早于胞浆蛋白,提示可能存在一个信号的跨膜转运过程;同时伴有PTP的活性变化,可能反映了胞内蛋白酪氨酸残基的磷酸化与去磷酸化即时调节机制。