tRNA-包埋核酶在HepG2细胞中的抗HBV活性

已知 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶比裸露核酶在胎牛血清和 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞抽提液中有较高的稳定性 构建了 ｈ Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动下的抗 Ｈ Ｂ Ｖ（ａｄｒ 亚型）的 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶基因质粒,与携带 Ｈ Ｂ Ｖ 基因的ｐ１２Ⅱ质粒共转染 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞,用 Ｇ４１８ 筛选抗性细胞 分析稳定表达细胞中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ, Ｈ Ｂ Ｖ 抗原合成和新生 Ｄ Ｎ Ａ 合成,表明ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶比裸露核酶有较高的抑制 Ｈ Ｂ Ｖ 活性．ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶和裸露核酶分别使靶 Ｒ Ｎ Ａ 减少 ８２％ ～８７％ 和 ７５％ ～８１％ ,抗原减少 ７３％ ～８０％ 和７０％ ～７４％ 以及新生 Ｄ Ｎ Ａ 减少 ７４％ ～７６％ 和 ６７％ ～７１％ 结果指出,核酶,特别是 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶,对 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞中 Ｈ Ｂ Ｖ 表达和复制有明显抑制作用,可能作为 Ｈ Ｂ Ｖ 基因治疗的手段之一      

锤头状核酶在HepG2.2.15细胞内的抗HBV特性

乙型肝炎病毒 (HBV)C基因区的 3′端序列在HBV各亚型中是高度保守的 ,它编码的多肽链都富含精氨酸 ,同时与前基因组RNA的包装和病毒DNA的复制有关。因此 ,HBV中C基因的 3′端保守区是核酶介导的抗病毒研究的理想靶位点。针对上述位点设计了锤头状核酶RzC ,同时作为对照 ,设计了相应的突变型核酶dRzC。HepG2 .2 .15细胞系是由头尾相接的HBVayw亚型基因组转染肝癌细胞系HepG2而建立的一株能稳定分泌HBV各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系。因而用HepG2 .2 .15细胞进行核酶的抗病毒研究更接近于疾病的治疗过程。为此 ,把体外转录的核酶RzC和dRzC以及核酶表达载体pCRzC和 pCdRzC直接转染HepG2 .2 .15细胞。初步结果表明 ,体外转录的核酶RzC对HBV复制的抑制很弱 ,这可能是由于核酶在细胞内快速被RNA酶降解造成的 ;而通过内源性传递产生的核酶RzC能够明显地抑制HBV的复制。结果说明 ,锤头状核酶RzC在HepG2 .2 .15细胞内显示抗病毒感染的能力 ,有可能作为HBV基因治疗的一种手段     

一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用

目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2,并检测感染细胞对G418的抵抗作用;为验证改构RNA干扰载体的有效性,设计了2条针对HBx的RNA干扰序列以及针对编码萤光素酶cDNA的干扰序列并插入该载体,将含新霉素筛选标记的HBx的RNA干扰载体与辅助质粒在293T细胞中包装成慢病毒并感染过表达HBx的HepG2(嘌呤霉素抗性)细胞,运用G418筛选出稳定混合克隆,提取细胞总RNA,运用RT-qPCR检测其在HepG2细胞中对HBx RNA表达的抑制作用。结果:构建的载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,细胞获得G418抗性;HBx RNA干扰序列克隆入该载体可有效抑制肝癌细胞中过量表达的HBx mRNA。结论:构建了具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,运用该载体可有效筛选出抑制目的基因表达的G418抗性的稳定细胞株。     

M1RNA在基因治疗中的研究进展

E.coli RNase P复合体的M1RNA亚单位是一类具有催化活性的核酶,它切割tRNA前体分子（pre-tRNA）的5′端前导序列,产生成熟的tRNA分子。M1RNA主要通过结构特异性识别底物,不需要底物有特定的序列,从而可设计修饰过的核酶为抑制靶基因的表达,在消除染色体易位产生的肿瘤相关畸形染色体上,M1RNA是一种理想的工具,研究表明M1RNA作为一种新型核酶有着广阔的应用前景和极大的临床价值。     

逆转录病毒载体介导的RNA干扰稳定抑制肌肉生长抑制素GDF-8的表达

为将肌肉生长抑制素的干扰序列表达盒hU6-siGDF-8有效导入肌成纤维细胞C2C12中, 以pAV-hU6 + 27载体为基础构建逆转录病毒载体pXSN-hU6-siGDF-8, 并使之与pVSV-G质粒共转染GP-293细胞, 用包装出的病毒粒子感染宿主细胞C2C12, G418筛选稳定整合逆转录病毒的抗性细胞库。2周后, Western Blotting和Real-Time PCR分析结果显示, 细胞内源性的GDF-8基因的表达得到了有效的抑制; MTT法和细胞流式仪分析表明, G418抗性细胞得到了更有效的增殖, 并且G0/G1期细胞数量减少了13.7%, S期细胞数量增加了14.9%。因此, 逆转录病毒载体的RNA干扰系统可以稳定抑制 GDF-8基因表达, 它将成为治疗肌肉萎缩疾病的一个强有力的工具。     

逆转录病毒载体介导的RNA干扰稳定抑制肌肉生长抑制素GDF-8的表达

为将肌肉生长抑制素的干扰序列表达盒hU6-siGDF-8有效导入肌成纤维细胞C2C12中, 以pAV-hU6 + 27载体为基础构建逆转录病毒载体pXSN-hU6-siGDF-8, 并使之与pVSV-G质粒共转染GP-293细胞, 用包装出的病毒粒子感染宿主细胞C2C12, G418筛选稳定整合逆转录病毒的抗性细胞库。2周后, Western Blotting和Real-Time PCR分析结果显示, 细胞内源性的GDF-8基因的表达得到了有效的抑制; MTT法和细胞流式仪分析表明, G418抗性细胞得到了更有效的增殖, 并且G0/G1期细胞数量减少了13.7%, S期细胞数量增加了14.9%。因此, 逆转录病毒载体的RNA干扰系统可以稳定抑制 GDF-8基因表达, 它将成为治疗肌肉萎缩疾病的一个强有力的工具。     

反义RNA寡核苷酸及其与脂质体的复合物对于乙型肝炎病毒的抑制（英文）

我们设计合成了特异性靶向乙型肝炎病毒(HBV)mRNA的反义RNA寡核苷酸P-2987、X-60和X-519.在瞬时转染pHBV1.3质粒(含有1.3拷贝的HBV基因组)的HepG2细胞和整合了HBV基因组的HepG2.2.15细胞中,转染2μmol/L的反义RNA寡核苷酸,ELISA和实时定量PCR结果表明,这3条寡核苷酸可以明显抑制HBV的复制和抗原表达.在HBV转基因鼠中,尾静脉注射反义RNA寡核苷酸,结果表明,肝脏中HBV的复制得到了抑制,但是血清中抗原含量和HBV DNA拷贝数没有明显变化.反义RNA寡核苷酸X-519与脂质体的复合物可以增强其对于HBV在肝脏中复制的抑制作用.在通过高压尾静脉注射pHBV1.3质粒建立的HBV急性感染模型中,反义RNA寡核苷酸X-519可以显著地抑制HBV在肝脏中的复制以及降低血清中病毒抗原水平和DNA拷贝数.上述实验结果说明,X-519及其与脂质体的复合物对于HBV的复制和抗原表达起到明显的抑制作用,可能作为一种潜在的针对HBV的基因治疗药物.     

反义RNA寡核苷酸及其与脂质体的复合物对于乙型肝炎病毒的抑制

我们设计合成了特异性靶向乙型肝炎病毒(HBV)mRNA的反义RNA寡核苷酸P-2987、X-60和X-519.在瞬时转染pHBV1.3质粒(含有1.3拷贝的HBV基因组)的HepG2细胞和整合了HBV基因组的HepG2.2.15细胞中,转染2μmol/L的反义RNA寡核苷酸,ELISA和实时定量PCR结果表明,这3条寡核苷酸可以明显抑制HBV的复制和抗原表达.在HBV转基因鼠中,尾静脉注射反义RNA寡核苷酸,结果表明,肝脏中HBV的复制得到了抑制,但是血清中抗原含量和HBV DNA拷贝数没有明显变化.反义RNA寡核苷酸X-519与脂质体的复合物可以增强其对于HBV在肝脏中复制的抑制作用.在通过高压尾静脉注射pHBV1.3质粒建立的HBV急性感染模型中,反义RNA寡核苷酸X-519可以显著地抑制HBV在肝脏中的复制以及降低血清中病毒抗原水平和DNA拷贝数.上述实验结果说明,X-519及其与脂质体的复合物对于HBV的复制和抗原表达起到明显的抑制作用,可能作为一种潜在的针对HBV的基因治疗药物.     

锤头状核酶在鸡胚成纤维细胞中的对鹅副粘病毒SF02繁殖的抑制作用

针对鹅副粘病毒SF0 2的F基因 ,设计了锤头状核酶RzF5 98,并插入真核细胞表达载体pcDNA3获得该核酶的转基因质粒pcDNA RzF5 98。以无核酶功能的突变体dRzF5 98和pcDNA3空质粒为对照 ,分析核酶对病毒繁殖的抑制作用。结果表明 ,RzF5 98不仅能在体外成功切割靶基因的mRNA ,还能有效抑制SF0 2在鸡胚成纤维细胞中的繁殖。转染pcDNA RzF5 98的鸡胚成纤维细胞经SF0 2感染后存活率可达 80 %左右 ,而未转染任何质粒的细胞和转染pcDNA3空质粒的细胞经SF0 2感染后存活率只有约 5 %。转染dRzF5 98的细胞对病毒也具有一定抗性 ,这可能是由于反义RNA的作用。     

FLT3配基在人骨髓基质细胞系中的基因转移与表达

目的：研究逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞系HFCL中的表达。方法：采用脂质体法将重组质粒pLF-SN/HFCL和空载体pLXSN/HFCL转染包装细胞PA317,G418筛选抗性克隆,用抗性克隆上清液感染HFCL。RT－PCR和基因组DNA－PCR检测外源基因mRNA水平的表达及染色体的整合,小鼠CFU－GM集落法检测FL生物学活性。结果：在mRNA水平上有FL的表达,染色体基因组中整合有标记neo基因和FL基因。活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论：提示骨髓基质细胞可作为基因治疗的靶细胞。     

Entwicklungsgeschichte und Ultrastruktur von Pollenkitt und Exine bei nahe verwandten entomophilen und anemophilen Angiospermensippen derAlismataceae,Liliaceae, Juncaceae,Cyperaceae, Poaceae undAraceae

Some closely related members of the monocotyledonous familiesAlismataceae, Liliaceae, Juncaceae, Cyperaceae, Poaceae andAraceae with variable modes of pollination (insect- and wind-pollination) were studied in relation to the ultrastructure of pollenkitt and exine (amount, consistency and distribution of pollenkitt on the surface of pollen grains). The character syndromes of pollen cementing in entomophilous, anemophilous and intermediate (ambophilous or amphiphilous) monocotyledons are the same in principal as in dicotyledons. Comparing present with former results one can summarize: 1) The pollenkitt is always produced in the same manner by the anther tapetum in all angiosperm sub-classes. 2) The variable stickiness of entomophilous and anemophilous pollen always depends on the particular distribution and consistency of the pollenkitt, but not its amount on the pollen surface. 3) The mostly dry and powdery pollen of anemophilous plants always contains a variable amount of inactive pollenkitt in its exine cavities. 4) A step-by step change of the pollen cementing syndrome can be observed from entomophily towards anemophily. 5) From the omnipresence of pollenkitt in all wind-pollinated angiosperms studied one can conclude that the ancestors of anemophilous angiosperms probably have been zoophilous (i.e. entomophilous) throughout.

     

Identification and Characterization of the First Equine Parainfluenza Virus 5

正Dear Editor,Parainfluenza virus 5 (PIV5), known as canine parainfluenza virus in the veterinary field, is a negative-sense,nonsegmented, single-stranded RNA virus belonging to the Paramyxoviridae family (Chen 2018). The virus was first reported in primary monkey kidney cells in 1954 (Hsiung1972), then it has been frequently discovered in various     

Pathogenic Characterization and Full Length Genome Sequence of a Reassortant Infectious Bursal Disease Virus Newly Isolated in Pakistan

<正>Dear Editor,Infectious bursal disease (IBD) is one of the most important diseases of the poultry. The IBD virus (IBDV), a nonenveloped virus belonging to the Birnaviridae family with a genome consisting of two segments of double-stranded RNA (segments A and B), targets B lymphocytes of bursa of Fabricious leading to immunosuppression. In Pakistan,poultry farming is the second biggest industry and IBD is the second biggest disease threating the poultry sector.However, there is limited genome information of IBDV     

Mink Circovirus Can Infect Minks,Foxes and Raccoon Dogs

正Dear Editor,Mink circovirus (MiCV), which is clustered in the genus Circovirus of the family Circoviridae, was first described in minks from farms in Dalian, China in 2013 (Lian et al.2014). The complete single-stranded circular genome of the virus is 1,753 nucleotides long and contains two major open reading frames (ORFs), designated ORF1 (Rep gene)and ORF2 (Cap gene)(Lian et al. 2014; Ge et al. 2018).Sequence analysis has shown that MiCV is most closely     

CypA Regulates AIP4-Mediated M1 Ubiquitination of Influenza A Virus

Cyclophilin A (CypA) is a peptidyl-prolyl cis/trans isomerase that interacts with the matrix protein (M1) of influenza A virus (IAV) and restricts virus replication by regulating the ubiquitin–proteasome-mediated degradation of M1. However,the mechanism by which CypA regulates M1 ubiquitination remains unknown. In this study, we reported that E3 ubiquitin ligase AIP4 promoted K48-linked ubiquitination of M1 at K102 and K104, and accelerated ubiquitin–proteasome-mediated degradation of M1. The recombinant IAV with mutant M1 (K102 R/K104 R) could not be rescued, suggesting that the ubiquitination of M1 at K102/K104 was essential for IAV replication. Furthermore, CypA inhibited AIP4-mediated M1 ubiquitination by impairing the interaction between AIP4 and M1. More importantly, both the mutations of M1 (K102 R/K104 R) and CypA inhibited the nuclear export of M1, indicating that CypA regulates the cellular localization of M1 via inhibition of AIP4-mediated M1 ubiquitination at K102 and K104, which results in the reduced replication of IAV.Collectively, our findings reveal a novel ubiquitination-based mechanism by which CypA regulates the replication of IAV.