黄萎病菌诱导的海岛棉抗病反应的SSH文库构建及分析

在Pima90幼苗接种黄萎病病原菌后2、4、8、12、24、48、72和96h分批取幼根以抽提棉花总RNA。以未接种病原的棉花cDNA为驱动方,利用SSH法对接种病原后的棉花cDNA进行差减杂交。对杂交后的cDNA进行T／A克隆并转化到大肠杆菌中完成文库构建,共获得了534个克隆。以M13引物对扩增插入片段进行PCR扩增,电泳结果显示插入片段大小从0．2—1．2kb不等,平均大小为0．5kb。将克隆中的插入片段点种于尼龙膜上,分别以病原诱导前后的总cDNA为探针进行反向Northern杂交。对78个在海岛棉的抗病反应中呈上升表达的克隆进行了测序并对测序结果去载体后在NCBI上利用Blastn和Blastx进行序列相似性分析。结果表明,大部分阳性克隆与拟南芥等多个物种不同逆境条件下诱导的相关基因或表达序列相同或同源,如棉花病程相关蛋白家族10,拟南芥抗病反应家族蛋白等。SSH文库的构建和分析将有助于了解棉花抗黄萎病反应的分子机制。     

应用抑制性消减杂交技术筛选流感病毒感染宿主应答基因

从宿主系统寻找病毒感染特异性相关的生物大分子是研究病毒药物靶标和诊断标志物的新方向 .为了筛选宿主细胞中流感病毒感染特异性基因 ,采用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以流感病毒A 鲁防 93 9(H3N2 )感染MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库 ,PCR法扩增鉴定其中插入片段大小 .从差减文库中随机挑取 10 0个克隆进行测序 ,用生物信息学方法对其同源性和基因功能进行分析和预测 .结果显示 ,成功构建了流感病毒感染特异性差减cDNA文库 ,文库中cDNA片段长度在 2 5 0～ 10 0 0bp之间 .从文库中随机选取 10 0个克隆测序 ,获得了 95个有效序列 ,经blast同源性分析发现 ,大部分基因为参与宿主细胞能量代谢和蛋白质生物合成过程中的基因 ;其中 19个为无任何功能线索的新基因片段 .流感病毒感染特异性差减cDNA文库的建立和筛选出病毒感染应答候选新基因cDNA片段 ,为发现新型流感病毒药靶和诊断标志物以及病毒感染机制研究打下基础     

大豆抗病基因同源序列的克隆与分析

已克隆的植物抗病基因序列存在一些相对保守的结构区域。利用根据核苷酸结合位点(NBS)结构域扩增所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针,进行大豆cDNA文库筛选。通过筛库和5′RAcE-PcR扩增后,获得一全长基因KR3。KR3的长度为2353 bp,编码636个氨基酸。KR3蛋白在结构上与烟草抗花叶病毒N基因蛋白有较高的同源性,具有Toll／白细胞介素-1受体(TIR)、NBS等抗病基因的分了特征。Southern 杂交显KR3在基因组中为低拷贝：RT-PCR分析表明,该基因的表达受外源水杨酸的诱导。     

大豆抗病基因同源序列的克隆与分析

已克隆的植物抗病基因序列存在一些相对保守的结构区域.利用根据核苷酸结合位点(NBS)结构域扩增所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针,进行大豆cDNA文库筛选.通过筛库和5'RACE-PCR扩增后,获得一全长基因KR3.KR3的长度为2353 bp,编码636个氨基酸.KR3蛋白在结构上与烟草抗花叶病毒N基因蛋白有较高的同源性,具有Toll/白细胞介素-1受体(TIR)、NBS等抗病基因的分子特征.Southern杂交显示KR3在基因组中为低拷贝;RT-PCR分析表明,该基因的表达受外源水杨酸的诱导.     

簇毛麦端体6VS的显微切割及其专化DNA序列的克隆和分析

从簇毛麦（Haynaldia villosa (L.)Schur.)组合CA9211／RW15（6D／6V异代换系）幼胚培养SC2后代中,用原位杂交方法鉴定出T240－6为6VS端体异代换系。以此为材料,采用微细玻璃针切割法及“单管反应”技术体系,对6VS进行切割分离及LA（Linker adaptor)-PCR扩增。扩增带在100－3000bp之间,大部分集中在600－1500bp。利用^32P标记的簇毛麦基因组为探针进行Southern杂交,证实扩增产物来源于簇毛麦。扩增产物纯化后,连续到pGEM-T载体上,构建了6VS DNA质粒库。对库的分析表明,库大约有17000个白色克隆;插入片段分布在100－1500bp,平均600bp。点杂交结果表明,37％克隆有中度到强烈的杂交信号,证明含有中度或高度重复序列;63％克隆有较弱的信号或没有信号,证明为单／低拷贝序列克隆。从库中获得8个簇毛麦特异克隆,对其中两个克隆pHVMK22和pHVMK134进行了RFLP分析和序列分析,并利用该探针对小麦抗白粉病基因Pm21进行了检测。RFLP结果表明,两个克隆一个为低拷贝序列克隆（pHVMK22),另一个为高度重复序列克隆,均为簇毛麦专化DNA序列。以pHVMK22为探针对抗、感病小麦（Triticum aestivum L.)品系的Southern杂交发现抗病品系有一条2kb的特征带,该探针可能作为检测抗病基因Pm21的探针。     

人ZP3基因的RT-PCR cDNA克隆

目的：研究人ZP3基因的结构及构建人ZP3基因原核表达系统。方法：从人卵巢组织中分离出mRNA并以此作为模版,通过RT—PCR扩增出人ZP3基因cDNA片段,然后将其克隆在pUC18质粒上,并对克隆片段进行序列分析。结果：共克隆到ZP3-A（1300bp）、ZP3-B（1180bp）、ZP3-C（1200bp）和ZP3-D（1080bp）4种不同长度的人ZP3基因cDNA片段,对其中最长的ZP3-A片段的测序结果表明,它包含了人ZP3基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的人ZP3 mRNA序列（NM-007155）相比较,在1275bp长的编码区内只有一个碱基不同,两者同源性达到99．92％。结论：本研究克隆到的ZP3-A cDNA片段确是人ZP3基因无疑。     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38抗病相关基因片段的分离

利用差异显示技术,分析小麦TcLr38受小麦叶锈菌诱导的mRNA表达丰度差异,获得了136条差异条带。对136条差异条带进行了回收、重扩增和反向Northern杂交检测,获得一条杂交信号阳性的片段,对该片段进行克隆、测序,该片段长度为425bp。在GenBank中进行Blast比对分析,与普通小麦(Triticum aestivum)同源性较高,并且与小麦抗盐cDNA序列也有较高的同源性;在GrainGenes中进行Blast比对,与小麦的远源亲本粗山羊草(Aegilops tauschii)、栽培一粒小麦(T.monococ-cum)和普通小麦具有较高同源性。利用SegMan软件进行电子克隆延长该片段,未找到与其相符的重叠群。因此确定该片段为TcLr38的cDNA片段,并初步推测该片段可能为一小麦抗病相关基因片段。     

文昌鱼性腺差减cDNA文库的构建

本研究以日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)性腺cDNA为材料,应用抑制性差减杂交技术构建文昌鱼雌雄性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以卵巢为试验方、精巢为驱动方,反向差减杂交以精巢为试验方、卵巢为驱动方,将所获差减cDNA片段克隆插入质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含459、243个重组子.PCR 扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段,其中90%左右的克隆皆能扩增出有效产物,插入片段范围为200-600 bp,符合差减文库PCR产物片段的大小.随机选取30个阳性克隆测序分析,得到26有效基因片段,进一步从中选取16个序列,用实时定量PCR对文库质量进行验证,结果表明所建文库能够达到富集雌雄性腺差异表达基因的目的.文昌鱼性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定性腺分化和发育相关基因奠定了基础[动物学报 54(3):482-48 8,2008].     

性逆转石斑鱼性腺差异表达基因的克隆和筛选

以 17α 甲基睾丸酮 (17α MT)饲喂 2～ 4龄赤点石斑鱼 (Epinephelusakaara) ,成功地促使其性转变为具有生殖功能的雄鱼 .应用抑制性差减杂交 (SSH)技术构建了石斑鱼性反转前后性腺组织的SMARTcDNA文库及其cDNA差减文库 ,从中随机挑取 12 0 0个克隆进行了PCR和斑点杂交筛选 ,得到 12 0个差异表达cDNA片段 .挑选 71个cDNA克隆测序 ,将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较 ,发现有 5 1个cDNA片段序列无明显的同源性 ,2 0个片段与报道的基因有较高同源性 .在这 2 0个具同源性的片段中有 3个片段可能是与性别分化密切相关的重要功能基因 ,它们是钙调蛋白基因、活性蛋白激酶C受体基因和一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因 .这 3个基因被分别命名为鱼钙调蛋白基因 (GenBankaccession :AY2 8136 3)、鱼活性蛋白激酶C受体基因 (GenBankaccession :AY2 8136 4)和鱼一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因 (GenBankaccession :AY2 8136 5 ) .     

不结球白菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及表达

从不结球白菜CMS新种质中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段,采用RT-PCR和RACE技术成功克隆了一个α-微管基因的cDNA全长序列,命名为TUBA2(DDBJ登录号为AB445012)。序列分析结果表明,该基因全长1 709 bp,最大开放阅读框为1 353 bp,编码450个氨基酸序列,与已公布的α-微管基因有较高的同源性。系统进化树分析发现,该基因在不同植物间具有高度保守性。Southern杂交表明TUBA2属于不结球白菜多基因家族的一个单一克隆基因。实时定量RT-PCR检测表明,该基因在不育系中的表达量显著低于保持系,同时在不同组织和细胞减数分裂不同时期该基因的表达量也存在明显差异。     

新型小鼠淋巴组织特异性肌动蛋白结合蛋白相关序列cDNA克隆

 应用抑制性差减杂交技术 ( SSH)克隆两种不同小鼠胸腺基质细胞的差异表达基因 ,获得新基因片段 C55.通过 Gen Bank检索及 RT- PCR扩增出一个全长 1 .4kb的 c DNA.杂交分析认为它是一个完整的 c DNA序列 .c DNA序列分析表明 ,它拥有一个 636bp的开放读码框架 ,编码 2 1 2个氨基酸 .同源序列比较发现 ,它编码一个肌动蛋白相关蛋白的新成员 ,该序列与多种已知的肌动蛋白相关蛋白 SM2 2 α及其同源蛋白在氨基酸水平上有 62 %～ 95%的同源性 .Northern杂交分析显示 ,该基因 m RNA转录本在两种不同胸腺基质细胞中的表达存在显著差异 . RT- PCR分析显示 ,该基因特异表达于小鼠淋巴相关组织中 ,而在非淋巴组织中无表达 .     

不结球白菜BcLRK01基因对芜菁花叶病毒及胁迫诱导的响应

通过cDNA-AFLP技术,从芜菁花叶病毒(TuMV)侵染的不结球白菜幼叶中分离到一条差异表达的基因片段,克隆获得其cDNA全长为2 124bp,编码707个氨基酸的富亮氨酸重复类受体激酶,命名为BcLRK01。利用实时定量PCR研究了该基因在TuMV侵染及高盐、冷胁迫、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)等处理下的表达情况,结果显示,TuMV侵染、高盐、冷胁迫、SA、JA和ET等均能诱导BcLRK01不同程度的表达,说明该基因可能是不结球白菜病毒病的病程相关基因,同时也参与高盐和冷胁迫以及SA、JA、ET等的信号途径。     

Characterization and regulation of Schizosaccharomyces pombe gene encoding thioredoxin

A cDNA coding thioredoxin (TRX) was isolated from a cDNA library of Schizosaccharomyces pombe by colony hybridization. The 438 bp EcoRI fragment, which was detected by Southern hybridization, reveals an open reading frame which encodes a protein of 103 amino acids. The genomic DNA encoding TRX was also isolated from S. pombe chromosomal DNA using PCR. The cloned sequence contains 1795 bp and encodes a protein of 103 amino acids. However, the C-terminal region obtained from the cDNA clone is -Val-Arg-Leu-Asn-Arg-Ser-Leu, whereas the C-terminal region deduced from the genomic DNA appears to contain -Ala-Ser-Ile-Lys-Ala-Asn-Leu. This indicates that S. pombe cells contain two kinds of TRX genes which have dissimilar amino acid sequences only at the C-terminal regions. The heterologous TRX 1C produced from the cDNA clone could be used as a subunit of T7 DNA polymerase, while the TRX 1G from the genomic DNA could not. The upstream sequence and the region encoding the N-terminal 18 amino acids of the genomic DNA were fused into the promoterless beta-galactosidase gene of the shuttle vector YEp357 to generate the fusion plasmid pYKT24. Synthesis of beta-galactosidase from the fusion plasmid was found to be enhanced by hydrogen peroxide, menadione and aluminum chloride. It indicates that the expression of the cloned TRX gene is induced by oxidative stress.     

Isolation and Characterization of a Class I SLG Gene from Chinese Cabbage (Brassica campestris)

In Brassica species, self-incompatibility in the recognition reaction between self and non-self pollens is determined by two genes, SLG and SRK, at the S locus. We have cloned and characterized a genomic DNA fragment containing a complete open reading frame of the SLG gene from Chinese cabbage. The genomic clone, named BcSLG2, was found to possess the region that shares a homology of 77% in amino acid identity with the SLG46 gene of Brassica campestris. Northern blot analysis revealed that the BcSLG2 gene expression is restricted to the pistil of Chinese cabbage flower. In situ hybridization showed that in the pistil, the gene is expressed predominantly in the stigmatic tissue. Much lower expression in the tapetum was also detectable at an immature stage of the flower development. Southern blot hybridization with the BcSLG2 DNA probe showed polymorphism in the SLG gene organization of the Chinese cabbage plants. These results will provide valuable information in understanding the S gene complex of the Chinese cabbage plants.     

丹参咖啡酸-O-甲基转移酶基因(SmCOMT1)的克隆及其分析

依据丹参转录组数据库得到的咖啡酸-O-甲基转移酶基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法从丹参分离得到一个新的COMT基因,命名为SmCOMT1(GenBank注册号为JF693491）。该基因cDNA全长1 158 bp,包含一个长为1 095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。SmCOMT1 gDNA序列长2 275 bp,包含4个外显子和3个内含子。序列分析结果表明,SmCOMT1编码的多肽具有COMT的序列保守元件,与同科植物罗勒COMT编码的多肽高度同源,同源性达到89%。系统进化树分析表明,SmCOMT1与双子叶植物的COMT亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,SmCOMT1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其中茎中的表达量最高,并且其表达受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导,显示SmCOMT1基因可能在植物防御反应中发挥作用。     

Cloning and characterization of the EIN2-homology gene LeEIN2 from tomato.

A full-length cDNA, named LeEIN2 was cloned from tomato (Lycopersicon esculentum) by RT-PCR and RACE. Then the genomic DNA sequence of LeEIN2 was isolated by LA (Long and Accurate) PCR and Inverse PCR. This DNA sequence was 6838 bp including six introns. The LeEIN2 cDNA was 4343 bp and contained a 3951 bp open reading frame, encoding a 142.63 kDa protein of 1316 amino acids. Comparison of this protein sequence with that of Arabidopsis and Petunia showed that the amino acid homology was 66 and 90%, respectively. Northern blotting analysis indicated that the expression level of the LeEIN2 in young leaves was higher than in mature leaves and senescent leaves. During the development of fruits, the expression of the LeEIN2 was detected before mature green stage and got up to maximum at mature green and breaker stages, then reduced rapidly after breaker stage. The expression level of LeEIN2 in wild type tomato fruit at mature green stage did not distinctively change when treated with exogenous ethylene.     

Cloning and sequencing of the triacylglycerol lipase gene of Aspergillus oryzae and its expression in Escherichia coli

Aspergillus oryzae produces at least three extracellular lipolytic enzymes, L1, L2 and L3 (cutinase, mono- and diacylglycerol lipase, and triacylglycerol lipase, respectively). We cloned the triacylglycerol lipase gene (provisionally designated tglA) by screening a genomic library using a PCR product obtained with two degenerate oligonucleotide primers corresponding to amino acid sequences of L3 as probes. Nucleotide sequencing of the genomic DNA and cDNA revealed that the L3 gene (tglA) has an open reading frame comprising 954 nucleotides, which contains three introns of 47, 83 and 62 bp. The deduced amino acid sequence of the tglA gene corresponds to 254 amino acid residues including a signal sequence of 30 amino acids and, in spite of the difference in substrate specificity, it is homologous to those of cutinases from fungi. Three residues presumed to form the catalytic triad, Ser, Asp and His, are conserved. The cloned cDNA of the tglA gene was expressed in Escherichia coli, and enzyme assaying and zymography revealed that the cloned cDNA encodes a functional triacylglycerol lipase.     

不结球白菜BcMPK4基因的分离及表达

为了进一步探讨植物MAPKs(mitogen-activated protein kinases)在植物防卫中的作用,该研究从不结球白菜抗病品种‘苏州青’中克隆到一个抗核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)相关基因,命名为BcMPK4(DDBJ登录号AB557751)。该基因核苷酸序列全长1 334bp,编码373个氨基酸,与已克隆的MPK4基因有不同程度的相似性。系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性。基因组DNA杂交表明,BcMPK4可能属于一个较小的多基因家族,属组成型表达。实时定量PCR检测表明,核盘菌能够诱导不结球白菜BcMPK4基因的转录表达;BcMPK4基因在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对核盘菌的抗性。