新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法研究进展

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)席卷全球,具有较高的传染性和死亡率,但目前尚缺乏安全有效的COVID-19疫苗与治疗药物.新型冠状病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)的进化高度保守,在调控新冠病毒RNA复制中具有重要的生物学功能,已成为新型广谱抗冠状...     

新型三明治样荧光偏振筛选模型在新型冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂筛选中的应用

新型冠状病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)通过水解多聚蛋白质体(polyprotein)调控病毒基因组RNA复制,且人体不存在其同源蛋白酶,这使Mpro成为抗新型冠状病毒药物开发的理想靶标之一。本研究基于荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)和生物素-亲和素反应(biotin-avidin system, BAS)原理,成功地建立了三明治样荧光偏振筛选模型用于Mpro小分子抑制剂的快速筛选。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现了漆树酸(anacardic acid,AA)是Mpro的竞争型抑制剂,1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose,PGG)是Mpro的混合型抑制剂,且已报道的部分抑制剂是非特异性Mpro小分子抑制剂。文中建立的三明治样荧光偏振筛选模型具有良好的简便性、灵敏性和稳定性,初步证实了漆树酸和PGG是一类新型苗头化合物,建立科学严谨的活性评价体系对于抗新型冠状病毒药物的筛选与发现是至关重要的。     

新冠病毒主蛋白酶特异性荧光底物ddRFP-M的制备与鉴定

传统的新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)多肽底物具有制备成本高、稳定性差和合成工艺复杂等缺点,积极开发廉价稳定的新型底物具有重要意义。本研究基于二聚化红色荧光蛋白(dimerization-dependent red fluorescent protein, ddRFP)原理,以AVLQS为连接肽,利用基因工程技术制备Mpro特异性荧光底物ddRFP-M,用于Mpro抑制剂的药理活性评价。将连接肽基因插入到密码子优化的RFP-A₁与RFP-B₁基因之间,构建ddRFP-M基因,再将其克隆到pET-28a载体中构建重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,以卡那霉素抗性法筛选重组子。重组子经低温诱导后,在大肠杆菌中进行荧光底物ddRFP-M的可溶表达,并以HisTrap^TM层析柱进行分离纯化。以荧光动力学检测法和电泳法测定ddRFP-M的底物特异性,并利用荧光底物ddRFP-M评价恩赛特韦和黄芩素的药理活性。结果显示,荧光底物ddRFP-M在大肠杆菌中呈可溶表达并成功进行了分离纯化,其具有良好的底物特异性、灵敏性和可靠性。新冠病毒Mpro特异性荧光底物ddRFP-M的制备,为新冠病毒Mpro抑制剂的药理活性评价奠定了基础。     

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂酶联免疫吸附法高通量筛选模型的优化与应用

在经典的Wnt/β-catenin信号通路中,β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4)相互作用在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)的生长分化、化疗耐药、转移复发等过程中发挥着重要的促进作用,已成为新型靶向性抗NSCLC转移药物开发的理想靶标之一.为了...     

日本脑炎病毒NS3蛋白酶活性检测及抑制剂高通量筛选方法的建立

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是单股正链RNA病毒,全基因组仅含有一个开放阅读框,编码一条多聚蛋白前体,病毒编码的NS3蛋白酶在JEV多聚蛋白加工过程中起着重要作用,是重要的药物靶标。通过PCR扩增了NS2BH-NS3蛋白酶的编码区,构建了原核表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到可溶性的NS3蛋白酶,用镍亲和层析方法进行了纯化。建立了基于荧光共振能量转移的NS3蛋白酶活性检测方法,并确定了最佳的反应条件,对113个化合物进行了筛选,发现其中两个化合物对JEV NS3蛋白酶具有一定的抑制活性。本研究为JEV NS3蛋白酶的活性研究及抑制剂筛选提供了一种操作方便、成本低廉的方法。     

SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选及抑制动力学研究

对SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS-CoV M^pro)进行异源重组表达与提纯,并以其为靶点,利用基于荧光共振能量转移(FRET)技术的体外药物筛选模型,对蛋白酶抑制剂聚焦库96种化合物进行了体外抑制活性的评价,并从动力学的角度探讨筛选出的阳性化合物对SARS-CoV M^pro的抑制能力与机制。结果表明:通过筛选获得抑制率>80%、淬灭率<20%的化合物5种,为P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-28、P-2-54,其半数有效抑制浓度(IC₅₀)分别为:0.69±0.05μmol/L、1.19±0.41μmol/L、0.14±0.01μmol/L、1.36±0.07μmol/L、0.36±0.03μmol/L。其中化合物P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-54对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制作用为不可逆抑制,化合物P-2-28的抑制作用为可逆抑制。根据Lineweaver-Burk图和Dixon图的研究,发现化合物P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶呈竞争性抑制,抑制常数Ki为0.81μmol/L。通过对底物浓度,IC₅₀值及Ki值关系的研究,进一步验证了P-2-28的抑制作用为竞争性抑制。该抑制剂的发现为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的研究打下基础,为抗SARS病毒药物开发提供了先导化合物。     

基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针的构建及应用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是基于荧光基团供体和荧光基团受体间偶极子–偶极子耦合作用的非辐射方式的能量传递现象。基于荧光蛋白的FRET技术已被广泛用于研究细胞信号通路中蛋白质–蛋白质活体相互作用检测、蛋白质构象变化监测以及生物探针的研制中。基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针使得人们可以在时间和空间层面上研究细胞信号的转导过程。该文简要介绍了四大类基于荧光蛋白的FRET生物探针的设计、研制以及其在生物信号分子检测、活细胞成像以及药物筛选中的应用和进展情况。     

基于细胞的新冠病毒蛋白酶活性报告系统及药物筛选应用

新型冠状病毒感染（Coronavirus disease 2019, COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的全球暴发性传染病,严重危害人类的生命安全。为了遏制新型冠状病毒感染,研究学者致力于研发抗病毒药物。为快速直接评价抗新冠病毒药物的有效性,研究构建了多种新冠病毒的新型报告系统。本文综述了基于目前新冠病毒两种蛋白酶（Mpro和PLpro）切割功能的报告系统相关研究进展,及其在抗病毒药物研发中的应用。     

抗甲病毒化合物高通量筛选模型的建立与应用

建立抗甲病毒化合物高通量筛选模型可为筛选和分析抗甲病毒药靶提供技术基础。本研究以含有分泌型荧光素酶(Gaussialuciferase,GLUC)报告基因标记的重组辛德毕斯病毒XJ160-GLUC为分子基础,建立了抗甲病毒化合物的高通量筛选模型,并对感染复数、检测时间等参数进行优化。经过优化,筛选模型的Z’因子值可达到0.71,表明我们所建立的筛选模型具有较好的稳定性。应用该筛选模型对8080个五合一样品进行筛选,最终获得19个具有抗甲病毒活性的阳性化合物。本研究所建立的抗甲病毒化合物高通量筛选模型及抗甲病毒阳性化合物的发现为抗甲病毒靶标相关的研究提供了新的思路和信息。     

基于密码子优化策略的新型冠状病毒主蛋白酶在大肠杆菌中的表达条件优化与活性鉴定

新型冠状病毒主蛋白酶(Main protease,Mpro)在调控新冠病毒RNA复制中具有重要的生物学功能,且Mpro在冠状病毒中的进化高度保守并不易突变,已成为新型广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶标之一.为了制备高纯度、高活性的Mpro,根据密码子偏爱性原则,将优化的Mpro基因分别连接到pET-21a与pET-28a...     

The conserved asparagine in the HNH motif serves an important structural role in metal finger endonucleases

The HNH motif is a small nucleic acid binding and cleavage module, widespread in metal finger endonucleases in all life kingdoms. Here we studied a non-specific endonuclease, the nuclease domain of ColE7 (N-ColE7), to decipher the role of the conserved asparagine and histidine residues in the HNH motif. We found, using fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays, that the DNA hydrolysis activity of H545 N-ColE7 mutants was completely abolished while activities of N560 and H573 mutants varied from 6.9% to 83.2% of the wild-type activity. The crystal structures of three N-ColE7 mutants in complex with the inhibitor Im7, N560A-Im7, N560D-Im7 and H573A-Im7, were determined at a resolution of 1.9 A to 2.2 A. H573 is responsible for metal ion binding in the wild-type protein, as the zinc ion is still partially associated in the structure of H573A, suggesting that H573 plays a supportive role in metal binding. Both N560A and N560D contain a disordered loop in the HNH motif due to the disruption of the hydrogen bond network surrounding the side-chain of residue 560, and as a result, the imidazole ring of the general base residue H545 is tilted slightly and the scissile phosphate is shifted, leading to the large reductions in hydrolysis activities. These results suggest that the highly conserved asparagine in the HNH motif, in general, plays a structural role in constraining the loop in the metal finger structure and keeping the general base histidine and scissile phosphate in the correct position for DNA hydrolysis.     

Chromatin Remodelers Act Globally, Sequence Positions Nucleosomes Locally

The precise placement of nucleosomes has large regulatory effects on gene expression. Recent work suggests that nucleosome placement is regulated in part by the affinity of the underlying DNA sequence for the histone octamer. Nucleosome locations are also regulated by several different ATP-dependent chromatin remodeling enzymes. This raises the question of whether DNA sequence influences the activity of chromatin remodeling enzymes. DNA sequence could most simply regulate nucleosome remodeling through its effect on nucleosome stability. In such a model, unstable nucleosomes would be remodeled faster than stable nucleosomes. It is also possible that certain DNA elements could regulate remodeling by inhibiting the interaction of nucleosomes with the remodeling enzyme. A third possibility is that DNA sequence could regulate the outcome of remodeling by influencing how reaction intermediates collapse into a particular set of stable nucleosomal positions. Here we dissect the contribution from these potential mechanisms to the activities of yeast RSC and human ACF, which are representative members of two major classes of remodeling complexes. We find that varying the histone-DNA affinity over 3 orders of magnitude has negligible effects on the rates of nucleosome remodeling and ATP hydrolysis by these two enzymes. This suggests that the rate-limiting step for nucleosome remodeling may not involve the disruption of histone-DNA contacts. We further find that a specific curved DNA element previously hypothesized to inhibit ACF activity does not inhibit substrate binding or remodeling by ACF. The element, however, does influence the distribution of nucleosome positions generated by ACF. Our data support a model in which remodeling enzymes move nucleosomes to new locations by a general sequence-independent mechanism. However, consequent to the rate-limiting remodeling step, the local DNA sequence promotes a collapse of remodeling intermediates into highly resolved positions that are dictated by thermodynamic differences between adjacent positions.     

FRET技术及其在蛋白质-蛋白质分子相互作用研究中的应用

简要综述了FRET方法在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用方面的最新进展.蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位,由于细胞内各种组分极其复杂,因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法,例如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息,无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程.荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）是近来发展的一项新技术,此项技术的应用,为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究,提供一个非常便利的条件.     

利用荧光共振能量转移技术监测高通量低能量激光诱导细胞凋亡过程中caspase-3活性的动态变化

荧光共振能量转移可用于对生物大分子之间的距离进行定性、定量检测。应用荧光共振能量转移技术对高通量低能量激光诱导肺腺癌细胞凋亡过程中caspase-3的激活过程进行实时动态监测。实验结果表明:高通量低能量激光可以诱导肺腺癌细胞(human lung adenocarcinoma cell,ASTC-a-1)凋亡。同时荧光共振能量转移技术是一个有效的监测caspase-3在凋亡过程中活性动态变化的方法。     

生物大分子相互作用检测技术新进展———三色荧光级联荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET),是指能量从一种受激发的荧光基团(fluorophore)以非辐射的方式转移到另一种荧光基团的物理现象.FRET的能量转移效率是两个荧光基团间距离的函数,并对此距离十分敏感,它的有效响应距离一般在1～10nm之间,因而可被用于测定原子间及分子间的距离.这一特点使FRET技术在大分子构象变化、大分子之间相互作用、细胞信号通路等研究中发挥重要作用,成为生物医学研究中的重要方法.但细胞内的生物学过程常常涉及多于两个的大分子间相互作用,二色荧光基团的FRET技术不能满足这种生物学研究的需求.最近,两个研究小组在这方面取得突破,建立了分别基于共聚焦显微镜和流式细胞仪的三色荧光级联FRET技术.这一技术的出现将会极大地促进生物学及相关研究领域的发展.