穗花杉ISSR引物反应条件的优化与筛选

在研究穗花杉(Amentotaxus aragotaenia)的遗传多样性过程中,为了获得清晰、重复性好ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的多个因素包括模板浓度、Taq酶的选择和用量、Mg²⁺和dNTPs浓度及退火温度等指标等进行了筛选和优化,确定了穗花杉ISSR-PCR分析的最适扩增条件： 20 μL PCR反应体系中,2 μL 10×Taq酶配套缓冲液,1.8 U Taq聚合酶（上海生工公司）,0.2 μmol·L^-1引物,0.18 mmol·L^-1 dNTP,1.5～2.5 mmol·L^-1 MgCl₂,10 ng·μL^-1模板DNA。用来自不同居群7个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的10个引物。得到了92个位点,其中45个多态性位点,多态性位点比例为49%。     

简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与筛选

以豆科沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus)的基因组DNA制备ISSR-PCR模板。通过对聚合酶链式反应（PCR）体系中模板DNA浓度,Mg^2 浓度,dNTP的用量,Taq酶的含量以及退火温度梯度进行试验。探讨筛选出清晰,多态性高,可重复性好的ISSR引物的PCR反应条件,用100个ISSR引物进行了PCR扩增,筛选出效果较好的15个引物,得到121个位点,其中43个多态位点,多态位点比例为36%。     

獐ISSR-PCR反应体系的建立与优化及引物筛选

利用正交试验L₁₆(4⁵)对影响獐(Hydropotes inermis)ISSR-PCR反应的Taq DNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度及模板DNA浓度5个因素在4个水平上进行优化,同时对退火温度进行梯度PCR反应,以建立适合于獐ISSR-PCR反应的最佳体系.最终确定獐25μL ISSR-PCR反应体系为:Taq酶1.25 U·25μL^-1、Mg²⁺浓度2.5 mmol·L^-1、引物浓度0.3μmol·L^-1、DNA模板量350 ng·25μL^-1、dNTP浓度0.15 mmol·L^-1.在此基础上,利用优化的反应体系成功筛选出10条用于獐相关研究的ISSR引物并确定了各自的最佳退火温度,为今后利用ISSR技术进行獐的物种鉴定与分类、亲缘关系、系统发育和生理病理学研究奠定了技术基础,也为开展其它大型资源动物如黑麂的保护遗传学研究提供理论基础.     

紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

以紫云英为研究材料,用哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物和11种株系紫云英品种的DNA为模板进行PCR扩增,筛选出33条扩增条带较好的ISSR引物,对其中的ISSR引物进行梯度PCR,筛选出最佳的退火温度。再采用正交试验和单因素试验相结合的方法对紫云英ISSR-PCR反应体系的5种因素(模板、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化浓度。确立了适合紫云英的ISSR分析的反应体系。在25μl反应体系中,其反应浓度为:DNA模版50.00ng,Mg2+2.00mol/L,Taq聚合酶1.0 U,dNTP 0.25mmol/L,引物0.20μmol/L,2.5μl 10×buffer。本试验为以后利用ISSR技术进行紫云英遗传多样性分析和物种保护奠定了技术基础。     

华中五味子ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

系统研究了华中五味子ISSR PCR反应体系中的主要影响因子,确立华中五味子ISSR-PCR最适反应体系,并筛选出12条有效引物。单因子实验结果显示,华中五味子ISSR-PCR反应体系中各主要成分的适宜浓度范围为,Mg²⁺ 1.50~3.50 mmol·L^-1,dNTPs 0.10~0.35 mmol·L^-1,引物0.25~0.60 μmol·L^-1,Taq酶0.50~1.50 U。4因子3水平正交实验确立了最适反应体系,即20 μL体系中包含2.50 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.20 mmol·L^-1 dNTPs、0.25 μmol·L^-1引物、1.50 U Taq酶、60 ng DNA模板、2.50 μL 10×PCR Buffer。本研究为华中五味子种质资源的评估及遗传多样性分析奠定基础。     

突托蜡梅ISSR引物反应条件的优化与筛选

为从突托蜡梅(Chimonanthus grammatus)叶片中提取高质量的总DNA,比较了CTAB法、改良的CTAB法、SDS法、高盐低pH值法、SDS-CTAB法、SDS-蛋白酶K法.结果表明:改良的CTAB是提取突托蜡梅基因组DNA的有效方法.以U811(GA)8C为引物,确立了适合突托蜡梅的ISSR反应体系:在20 μL反应体系(50 ng DNA、0.6 μmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2 、0.15 mmol/L dNTPs、2.0 U Taq DNA聚合酶)中,反应程序为:94℃预变性5 min、94℃变性1 min、57.2℃退火45 s、72℃延伸2 min,循环40次,最后于72℃延伸5 min.用来自不同居群的7个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出了扩增效果较好的10个引物,得到了74个位点,其中39个为多态位点,多态性位点比例为52.7%.     

葡萄SRAP反应体系优化及引物筛选

本试验利用L16(45)正交试验设计探寻葡萄SRAP-PCR反应体系中的关键因子,同时结合单因素试验简单、快捷的特点逐个对PCR反应体系的主要成分进行优化.充分利用两种方法的优点并降低试验工作量取得了较好的效果,建立了适于葡萄的SRAP反应体系.结果表明Mg2+浓度为影响葡萄SRAP-PCR反应的关键因素:优化的20 μL SRAP-PCR反应体系中各组分的最适含量为:10×Buffer 2.0μL,Mg2+2.5mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,引物0.4 μmol/L,DNA聚合酶1.0 U,模板DNA 1.0 ng/L.利用SRAP反应体系,从100对SRAP引物组合中筛选出扩增稳定,条带清晰,多态性好的引物19对.本研究建立的适于葡萄SRAP-PCR扩增的反应体系,将为葡萄种质遗传多样性评价、基因组分析、指纹图谱构建,分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础.     

牡丹品种鉴定用ISSR引物的筛选与开发

用于牡丹品种鉴定的DNAISSR-PCR反应体系已经建立。利用DNAISSR分子标记分析少量牡丹品种时,容易获得各品种的特有ISSR标记。然而,中国牡丹品种约有1500个,在小批量品种范围内找到的品种特有ISSR标记有可能出现在其它品种中。因此,利用DNAISSR分子标记对数量庞大的中国牡丹品种进行区分和鉴定时,寻找品种特有标记成为突出的技术难题。标记是由引物通过PCR扩增产生的。因此,关键在于找到理想的ISSR引物。对已知的ISSR引物的筛选未获得良好的PCR扩增结果。报道牡丹鉴定用ISSR引物的设计与开发新途径。     

棕榈ISSR反应条件的筛选与优化

应用ISSR技术对棕榈(Trachycarpusfortunei)进行分析研究,对影响ISSR反应的各因子进行探讨,确定了该研究的最佳反应条件,建立了棕榈ISSR反应的最佳反应体系,为进行棕榈居群遗传多样性的研究奠定了基础。     

海南龙血树ISSR-PCR反应体系建立与有效引物筛选

采用单因子试验与正交试验的方法,研究了海南龙血树(Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep)ISSR-PCR反应体系中的主要影响因子,筛选出16条有效引物并优化了它们的退火温度,此外还检测了体系的重复性.优化后的25μL反应体系包含:10×PCR buffer 2.5 μL,3.0 mm...     

厚朴叶和皮不同提取部位的药理作用比较研究

通过小鼠最大耐受量测定法进行厚朴叶的急性毒性研究,采用小鼠浓氨水引咳法、炭末推进法对厚朴叶和皮不同溶剂部位提取物的镇咳和胃肠推进作用进行了比较研究。结果显示厚朴叶小鼠最大耐受量为112g/kg,为厚朴成人每日用量的747倍,且7日内均未出现中毒和死亡现象。厚朴叶石油醚提取部位低剂量组、厚朴皮乙醚提取部位低剂量组和石油醚提取部位能明显延长氨水致小鼠咳嗽潜伏期或减少咳嗽的频率。同时,厚朴叶乙醚提取部位低剂量组能明显提高炭末在小肠中的推进率,厚朴皮乙醚提取部位低剂量组能显著减少炭末在胃中的残留率。以上结果表明:在实验剂量范围内,厚朴叶几无毒性;其低剂量的石油醚和乙醚提取部位有较强的镇咳和胃肠推进效果。提示其药用价值有深入研究的必要。     

不同树龄厚朴干、枝皮中的酚的分离及含量测定

应用高效液相色谱法,对都江堰市不同树龄厚朴干、枝皮中所含厚朴酚、和厚朴酚含量的动态分布进行了测定。结果表明：都江堰市不同树龄、不同部位厚朴中厚朴酚、和厚朴酚含量随树龄增大而增加,均在25年左右达到最高值;为厚朴药材质量评价、遗传改良及合理采收提供理论依据。     

Genetic diversity and relationship of endangered plant Magnolia officinalis (Magnoliaceae) assessed with ISSR polymorphisms

Twenty-eight populations of the rare medicinal plant Magnolia officinalis (Magnoliaceae) were sampled across its natural range, and inter-simple sequence repeats (ISSRs) markers were used to assess the genetic variation within and among populations. Twelve primer combinations produced a total of 137 unambiguous bands of which 114 (83.2%) were polymorphic. M. officinalis exhibited a relatively low genetic diversity at population level (the percentage of polymorphic loci PPB = 49.8%, Nei’s genetic diversity H = 0.194, Shannon’s information index I = 0.286). However, the genetic diversity at species level was relatively high (PPB = 83.2%; H = 0.342; I = 0.496). The coefficient of gene differentiation (G_ST, 42.8%) and the results of analysis of molecular variance (AMVOA) indicated that genetic differentiation occurred mainly within populations. The estimated gene flow (Nm) from G_ST was 0.669. It indicated that the fragmentation and isolation of populations might result from specific evolutionary history and anthropogenic activity. Genetic drift played a more important role than gene flow in the current population genetic structure of M. officinalis. Conservation strategies for this rare species are proposed based on the genetic data.     

山茱萸种质资源的ISSR遗传多样性分析与初级核心种质库的构建

采用ISSR 标记技术对不同来源地的48份山茱萸种质资源的遗传多样性进行了分析,并依据最小遗传距离逐步抽样法构建了该初级核心种质资源库.结果显示:筛选出的13个多态性引物共扩增出190个位点,多态性位点比率达93.16%,平均Shannon信息指数(I)为0.402 5,平均Nei's基因多样性指数(H)为0.259 4,平均有效等位基因数(NE)为1.425 0.聚类分析表明,种质间的遗传相似系数介于0.65～0.90之间,除个别种质外,48个种质聚类结果与地区来源有较高的一致性.随着抽取种质数目的减少,多态性比率明显降低,但种质库遗传多样性参数变化较小;抽样3构建的初级核心种质库最具代表性,抽样数是抽样前的30%左右,多态位点比率是抽样前的96.0%.     

厚朴叶中具血管舒张作用的化学成分研究

实验采用离体血管环灌流模型,观察厚朴叶正丁醇萃取部位对去甲肾上腺素预收缩的内皮完整和去除内皮的家兔离体血管环张力的影响。结果显示:厚朴叶正丁醇萃取部位对内皮完整和去除内皮的血管环在一定剂量内呈现浓度依赖性舒张作用,该作用可能与该部位大量成分———槲皮苷和芦丁有关。从该部位分离得到7个化合物,分别为槲皮苷(1),芦丁(2),紫丁香苷(3),丁香脂素-4,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷(4),芥子醛-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6),丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(7)。其中化合物4和6首次从该种植物中分离得到。     

厚朴野生种与栽培种花不同部位香气成分分析

以厚朴野生种和栽培种苞片刚裂开的花苞为试材,采用固相微萃取和气相色谱—质谱(GC/MS)分析技术对其进行香气成分和相对含量的测定,比较分析了花朵不同部位香气成分的差异。结果表明：厚朴野生种共有39种香气成分,雌雄蕊中26种,花瓣中22种,栽培种中75种香气成分,雌雄蕊中49种,花瓣中54种。萜烯类是两种厚朴花苞中最重要的香气化合物,莰烯、罗勒烯异构体混合物、石竹烯、芳樟醇是野生种和栽培种中共有的相对含量较高的香气成分。厚朴野生种和栽培种间以及同种厚朴雌雄蕊与花瓣之间的香气成分的种类和相对含量差异显著。     

不同花期厚朴雌雄蕊和花瓣香气组成成分的分析和比较

采用固相微萃取和GC-MS技术,对初花期、展瓣期、盛花期和盛花末期厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)雌雄蕊和花瓣香气的组成成分及其相对含量进行了分析和比较.结果表明:不同花期厚朴雌雄蕊和花瓣香气的组成成分及其相对含量差异明显.雌雄蕊和花瓣香气分别含有52和37种成分,总计67种;其中,1-甲氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯、1-香叶基乙醚、D-柠檬烯、莰烯、月桂烯和石竹烯等成分的相对含量均较高.初花期、展瓣期、盛花期和盛花末期雌雄蕊香气分别含有26、26、27和24种成分,花瓣香气则分别含有22、19、16和21种成分;不同花期雌雄蕊和花瓣香气的共有成分为1-甲氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯、D-柠檬烯和石竹烯.不同花期厚朴雌雄蕊和花瓣香气成分可分为萜烯类、醇类、芳香烃类、醚类、醛酮类、酯类、烷烃类和含氮类8类,共有类型为萜烯类和醇类,其中,萜烯类是主要组成成分.厚朴雌雄蕊和花瓣在不同花期均释放出较多的萜烯类化合物,其相对含量随着花的发育呈先升高后降低的趋势.根据感官分析与GC-MS分析结果综合判断:萜烯类化合物是组成厚朴花香气的重要成分;花瓣是香气释放的主要部位,而雌雄蕊则在香气释放过程中起辅助作用.     

ISSR variation in the endemic and endangered plant Cycas guizhouensis (Cycadaceae)

BACKGROUND AND AIMS: Cycas guizhouensis (Cycadaceae) is a rare and endangered species endemic to the southwest of China. An investigation was undertaken into the genetic variation of wild populations. METHODS: ISSR markers were used to determine the genetic variation within and between 12 extant populations of this species. KEY RESULTS: Low genetic diversity (at population level, P = 14.21 %, H(E) = 0.0597; at species level, P = 35.90 %, H(T) = 0.1082) and a high degree of differentiation among populations (G(ST) = 0.4321) were detected. CONCLUSIONS: This genetic structure is considered to be due to the combined effects of slow biochemical evolution, genetic drift, inbreeding and limited gene flow between populations. Based on these findings, strategies are proposed for the genetic conservation and management of the species.     

Population structure and genetic diversity distribution in wild and cultivated populations of the traditional Chinese medicinal plant Magnolia officinalis subsp. biloba (Magnoliaceae)

Magnolia officinalis subsp. biloba, a traditional Chinese medicinal plant, experienced severe declines in the number of populations and the number of individuals in the late 20th century due to the widespread harvest of the subspecies. A large-scale cultivation program was initiated and cultivated populations rapidly recovered the loss in individual plant numbers, but wild populations remained small as a consequence of cutting. In this study, the levels of genetic variation and genetic structure of seven wild populations and five domestic populations of M. officinalis subsp. biloba were estimated employing an AFLP methodology. The plant exhibited a relatively high level of intra-population genetic diversity (h = 0.208 and H _j = 0.268). The cultivated populations maintained approximately 95% of the variation exhibited in wild populations, indicating a slight genetic bottleneck in the cultivated populations. The analysis of genetic differentiation revealed that most of the AFLP diversity resided within populations both for the wild group (78.22%) and the cultivated group (85.92%). Genetic differentiation among populations in the wild group was significant (F _ST = 0.1092, P < 0.005), suggesting wild population level genetic structure. Principal coordinates analysis (PCO) did not discern among wild and cultivated populations, indicating that alleles from the wild population were maintained in the cultivated gene pool. Results from the present study provide important baseline data for effectively conserving the genetic resources of this medicinal subspecies.